斑馬魚腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、惡性腫瘤現(xiàn)已成為我國(guó)居民的主要死亡原因。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤難治、易復(fù)發(fā)的主要原因，其中腫瘤腦轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的最嚴(yán)重后果之一，一旦發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，預(yù)后非常差，5年存活率極低。因此，研究腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于我國(guó)癌癥病人來(lái)說(shuō)具有重要意義。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的三種癌癥。本課題旨在應(yīng)用模式動(dòng)物斑馬魚，建立用于腫瘤腦轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的活體模型，并進(jìn)一步探索腫瘤腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及腫瘤細(xì)胞外泌體在腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的作用。研究結(jié)果總結(jié)如下:

2、r>　　1.在血腦屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑馬魚胚胎心包腔部位注射帶有紅色熒光標(biāo)記的鼠源性黑素瘤細(xì)胞tfRFP-B16-F10，對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì):胚胎存活率、注射部位含有腫瘤細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目和各個(gè)部位包括頭部、軀干、尾部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，以及總體轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。同時(shí)我們選取移植后的幼魚進(jìn)行活體成像實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)觀察腫瘤細(xì)胞突破血腦屏障(Brain-Blood-Barrier，BBB)進(jìn)入腦組織的過(guò)程，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞是通過(guò)

3、不斷地變形穿過(guò)腦內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，在腦內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接出現(xiàn)以后，腫瘤細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移率大大降低，而緊密連接正是血腦屏障實(shí)現(xiàn)其功能的主要一部分，因此，我們得出結(jié)論:血腦屏障在抑制腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，另外，通過(guò)對(duì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移2d后的斑馬魚幼魚進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程轉(zhuǎn)盤共聚焦拍攝，我們發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞沿著血管壁擴(kuò)增延伸，細(xì)胞集群不斷擴(kuò)大，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的腦轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)情況相符，而且通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)，我們成功建立了研究腫瘤腦轉(zhuǎn)移的斑馬魚

4、模型。
　　2.在血腦屏障開始形成后即3dpf的斑馬魚幼魚心包腔部位注射3-D纖維軟膠培養(yǎng)富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性細(xì)胞和普通培養(yǎng)的tfRFP-B16-F10腫瘤細(xì)胞，分別統(tǒng)計(jì)注射不同培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的胚胎存活率、注射部位腫瘤細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目和各個(gè)部位包括頭部、軀干、尾部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，以及總體轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明3-D纖維軟膠培養(yǎng)的高致瘤性細(xì)胞無(wú)論是總體轉(zhuǎn)移率還是腦轉(zhuǎn)移率都要高于普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞。因此，高致瘤

5、性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能更強(qiáng)。另外，我們利用熒光顯微鏡連續(xù)觀察同一條幼魚體內(nèi)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，可以很明顯的觀察腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的生長(zhǎng)。
　　3.外泌體是30-100um的囊泡結(jié)構(gòu)，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，然而對(duì)于其作用機(jī)制的了解還不全面，因此我們擬利用本課題所建立的腫瘤腦轉(zhuǎn)移斑馬魚模型研究外泌體促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。我們利用DiI熒光染料使體外提取的外泌體帶上紅色熒光，將DiI-exosomes注射進(jìn)2dpf的斑馬魚胚胎心包腔部位

6、，利用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡觀察外泌體與血腦屏障腦內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)外泌體可以被綠色熒光標(biāo)記的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞吸收，并且紅色熒光與腦內(nèi)皮細(xì)胞的綠色熒光存在共定位長(zhǎng)達(dá)4h甚至更長(zhǎng)，結(jié)果說(shuō)明外泌體與腦內(nèi)皮細(xì)胞間存在相互作用，而這種相互作用很可能對(duì)腫瘤細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障具有重要影響。我們先后嘗試了5次tfRFP-B16-F10及其外泌體的共注射以及1次非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549及其外泌體的共注射，監(jiān)測(cè)腦轉(zhuǎn)移，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)