新型斑馬魚模型在研究腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管侵襲機(jī)制中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分新型斑馬魚腫瘤模型的建立及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的
　　研究背景:
　　現(xiàn)在在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率越來(lái)越高，而轉(zhuǎn)移常常是造成癌癥病人死亡的主要原因。是什么造成了腫瘤的轉(zhuǎn)移？越來(lái)越多的證據(jù)指向了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的由多種細(xì)胞和結(jié)構(gòu)成分混合而成的綜合體，包括腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等，腫瘤微環(huán)境可以為癌癥的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供支持。在各種被募集的細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞存在于

2、腫瘤進(jìn)展的各個(gè)階段而且數(shù)量巨大。一般情況下，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是可以吞噬異物，殺滅腫瘤細(xì)胞的，起到清道夫的作用，但是在許多臨床和基礎(chǔ)研究中卻發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞起到了促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。在原發(fā)腫瘤中，巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)新生血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移以及破壞血管進(jìn)入血液循環(huán)，在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的定植和生存。巨噬細(xì)胞有很多亞型，最常用的分型就是M1和M2，M1又叫做經(jīng)典途徑激活的巨噬細(xì)胞，與Th1輔助T

3、細(xì)胞對(duì)病原體的反應(yīng)有關(guān)，M2又叫做旁路途徑激活的巨噬細(xì)胞，與Th2輔助T細(xì)胞有關(guān)。有研究認(rèn)為，腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞已經(jīng)由M1亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2亞型。盡管許多研究認(rèn)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，但這仍然存在爭(zhēng)議。目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移的模型主要為小鼠模型，通常只能觀察腫瘤發(fā)展終末期發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況，但臨床實(shí)際情況是許多癌癥因?yàn)檗D(zhuǎn)移灶才明確了診斷，而那時(shí)原發(fā)腫瘤仍然很小甚至無(wú)法探測(cè)。所以如何研究腫瘤發(fā)生早期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍需要一種新的動(dòng)物模

4、型。
　　由于斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到了87％，而且具有繁殖快、花費(fèi)較少、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)，最近幾十年在生物科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。早在上世紀(jì)六十年代，斑馬魚就開(kāi)始被用做發(fā)育遺傳學(xué)中的動(dòng)物模型，而直到1982年，有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露在致癌物質(zhì)下的斑馬魚長(zhǎng)出了腫瘤，斑馬魚才開(kāi)始被用作腫瘤模型。相比與小鼠腫瘤模型，斑馬魚模型有兩個(gè)主要的優(yōu)勢(shì)，首先，斑馬魚不受動(dòng)物數(shù)量的限制，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組可以使用成百上千的胚胎，而小鼠如果每組超過(guò)1

5、0只就會(huì)耗費(fèi)大量的精力和財(cái)力;其次，在小鼠中如果要對(duì)移植的腫瘤細(xì)胞顯像，一般使用熒光蛋白或者生物發(fā)光，分辨率較低，而在透明的斑馬魚中則可以使用高分辨率熒光共聚焦顯微鏡對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行顯像。我們?cè)诖饲暗囊豁?xiàng)研究中將熒光染料標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞植入到斑馬魚的卵周隙中，建立了一種新的腫瘤模型，斑馬魚胚胎透明的特性使我們可以從單細(xì)胞水平對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行體內(nèi)顯像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織缺氧可以明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。而在本研究中，我們?cè)噲D通過(guò)引入腫瘤微環(huán)境中

6、不同的細(xì)胞成分來(lái)建立一種全新的斑馬魚模型。
　　目的:
　　本研究旨在使用斑馬魚胚胎建立腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用的腫瘤微環(huán)境的模型，然后使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性以及腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞（例如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）之間的關(guān)系。并結(jié)合臨床標(biāo)本對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行探討，研究多種不同的細(xì)胞因子刺激對(duì)巨噬細(xì)胞性質(zhì)變化的影響，評(píng)價(jià)不同的巨噬細(xì)胞亞型對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法:
　　1.使用

7、不同的細(xì)胞因子（IL6、TNFα、TG邛、IL4、IL10、LPS、IFNγ）體外刺激小鼠或者人的巨噬細(xì)胞，得到不同的巨噬細(xì)胞亞型M1和M2。
　　2.使用磁珠分選從小鼠或人的腫瘤組織中直接得到腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。
　　3.將不同顏色的熒光染料標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞單獨(dú)或者和巨噬細(xì)胞一起注射到受精后48h的轉(zhuǎn)基因FLi1∶EGFP斑馬魚胚胎的卵周隙中，建立腫瘤微環(huán)境模型。
　　4.使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡在單細(xì)胞

8、水平動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立了不同顏色的腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共存的腫瘤微環(huán)境模型。
　　2.使用IL6和TNFα體外刺激的巨噬細(xì)胞或者從高表達(dá)IL6和TNFα的腫瘤中分離出的巨噬細(xì)胞可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且大部分腫瘤細(xì)胞都跟巨噬細(xì)胞耦合在一起轉(zhuǎn)移。從野生型LLC腫瘤中分離出的巨噬細(xì)胞只能微弱地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞地轉(zhuǎn)移，而對(duì)照組使用P

9、BS進(jìn)行刺激的巨噬細(xì)胞并不能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　3.使用TGFβ、IL4和IL10共同刺激得到的或者從小鼠腫瘤組織中分離得到的M2亞型的巨噬細(xì)胞顯著的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，大部分轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞都伴隨著巨噬細(xì)胞。而使用LPS和IFNγ共同刺激得到的或者從小鼠腫瘤組織中分離得到的M1亞型的巨噬細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的特性。
　　4.從出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的臨床病人新鮮腫瘤組織中分離出的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在斑馬魚模型中能夠明顯促進(jìn)腫

10、瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而從沒(méi)有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的臨床腫瘤標(biāo)本中分離出的巨噬細(xì)胞只能夠微弱地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞相互作用的腫瘤微環(huán)境模型，并可使用多種顏色進(jìn)行體內(nèi)顯像。
　　2.IL6和TNFα的體外刺激或者體內(nèi)作用都可以改變巨噬細(xì)胞的性質(zhì)，使其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　3.體外刺激或者是從腫瘤組織分離得到的M2亞型的巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，而M1亞型的巨噬細(xì)胞沒(méi)

11、有表現(xiàn)出這種能力。
　　4.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力與其對(duì)應(yīng)臨床病人所患腫瘤是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，腫瘤的轉(zhuǎn)移需要通過(guò)TAMs的介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　第二部分斑馬魚原位腫瘤模型的建立及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究背景:
　　視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是兒童當(dāng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在眼內(nèi)腫瘤居于首位，常見(jiàn)于視網(wǎng)膜核層，有家族遺傳性，多發(fā)生于5歲以下兒童，可單眼、雙眼先后或同時(shí)患病，

12、極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑是從眼球的后極部開(kāi)始，沿視神經(jīng)入腦并向眼外蔓延，惡性程度高，死亡率高，因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療是提高生存率和降低死亡率的關(guān)鍵。手術(shù)治療是目前主要的治療手段，其他治療手段還包括化學(xué)治療、放射治療、冷凍治療、光凝治療等。
　　視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)病原因是Rb抑癌基因的全部?jī)蓚€(gè)等位基因失活導(dǎo)致了其抑癌功能的缺失，它是一種具有高度的遺傳傾向的惡性腫瘤，大約40％的病人為常染色體顯性遺傳，Rb基因攜帶者的后代大

13、約有50％的幾率發(fā)病。最近，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤作為遺傳性的腫瘤模型，越來(lái)越受到研究者們的重視。最初研究者們是將分離培養(yǎng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系例如Y79細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下成為移植瘤模型，或者是將腫瘤細(xì)胞注射到大鼠眼睛的玻璃體腔里建立原位瘤模型。此后，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，大量的轉(zhuǎn)基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤小鼠模型被應(yīng)用到基礎(chǔ)研究中，例如人為的使癌基因SV40-T抗原過(guò)表達(dá)建立了LHBETATAG視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤模型，多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型的出

14、現(xiàn)為研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生機(jī)制以及新型抗腫藥物的評(píng)價(jià)提供了便利，但是如何重現(xiàn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤多發(fā)于兒童的實(shí)際情況，如何在顯微水平研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生早期生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚缺乏理想的動(dòng)物模型。
　　目的:
　　本研究旨在使用斑馬魚胚胎建立視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的原位癌模型，然后使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡在單細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)地觀察腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及腫瘤細(xì)胞與血管之間的關(guān)系，并研究抗血管藥物或者嗎啉基對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。

15、
　　方法:
　　1.將不同的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系注射到Fli1∶EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎眼球中的玻璃體腔，建立原位腫瘤模型。
　　2.使用抗血管藥物舒尼替尼或者抑制腫瘤血管生長(zhǎng)因子的嗎啉基作用于斑馬魚胚胎，然后在不同的時(shí)間點(diǎn)使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的斑馬魚原位腫瘤模型。
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