斑馬魚甲狀腺破壞性疾病模型的構(gòu)建.pdf

1、目的:利用轉(zhuǎn)基因和紅色熒光蛋白示蹤技術(shù)，構(gòu)建活體的、由紅色熒光蛋白(mcherry)標(biāo)記甲狀腺可示蹤的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，以此為基礎(chǔ)，初步探索使用藥物化學(xué)誘導(dǎo)的方法定向破壞甲狀腺細(xì)胞。為進(jìn)一步研究以活體高通量篩選具甲狀腺細(xì)胞保護(hù)或再生的中草藥和小分子化合物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，如DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化及顯微注射等，建立紅色熒光蛋白(mcherry)標(biāo)記甲狀腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。運(yùn)用全胚胎原位雜交與顯微鏡活體成像技術(shù)

2、，證實mcherry標(biāo)記斑馬魚甲狀腺。初步探索在化學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立甲狀腺細(xì)胞破壞的活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型。
　　結(jié)果:1、將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定正確的重組質(zhì)粒tol2-th-promoter-nsfb-2a-mcherry進(jìn)行顯微注射，建立甲狀腺轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。
　　2、遺傳穩(wěn)定的F1代甲狀腺細(xì)胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的獲得依靠熒光顯微鏡篩選。顯微鏡活體成像和全胚胎原位雜交分別從不同的方向證實外源性目的基因to12-th

3、-promoter-nsfb-2a-mcherry整合進(jìn)入斑馬魚基因組。
　　3、動態(tài)觀察活體斑馬魚甲狀腺發(fā)育情況。從受精后38h從遠(yuǎn)端心室心肌的位置到受精后55小時甲狀腺細(xì)胞沿著咽中線擴(kuò)張。
　　4、將10mM甲硝唑與轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎共同孵育48小時，定向誘導(dǎo)直接破壞甲狀腺細(xì)胞。
　　結(jié)論:1、通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立了紅色熒光蛋白特異性標(biāo)記甲狀腺轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的穩(wěn)定性。
　　2、運(yùn)用全胚胎原位雜交進(jìn)一步證實了mc