新型分泌蛋白Leg1a和Leg1b在斑馬魚(yú)肝臟發(fā)育中的功能研究.pdf

1、肝臟作為脊椎動(dòng)物體內(nèi)一個(gè)功能重要的實(shí)體器官其發(fā)育過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜。肝臟的特化、分化，起始和生長(zhǎng)過(guò)程是在包括肝臟富集基因在內(nèi)的一系列時(shí)空特異性因子的協(xié)同作用下完成的。已有的研究報(bào)道顯示人們對(duì)于肝臟發(fā)育過(guò)程中涉及的各種分子調(diào)控機(jī)制還了解得不多。
　　 本實(shí)驗(yàn)室先前報(bào)道了一個(gè)新的功能未知的肝臟富集基因leg1。morpholino介導(dǎo)的基因敲低實(shí)驗(yàn)顯示該基因的下調(diào)導(dǎo)致了肝臟發(fā)育變小的表型。為了能夠進(jìn)一步明確該基因在斑馬魚(yú)肝臟發(fā)育中的作用，

2、本課題深入地分析了lee1在斑馬魚(yú)基因組中的結(jié)構(gòu)、定位，leg1表達(dá)特征及其在斑馬魚(yú)胚胎肝臟發(fā)育中的功能，同時(shí)還探討了Leg1敲低引起肝臟變小的分子機(jī)制。
　　 基因的結(jié)構(gòu)和定位分析結(jié)果顯示在斑馬魚(yú)基因組中l(wèi)eg1是一個(gè)重復(fù)基因，存在leg1a和leg1b兩個(gè)拷貝，它們串聯(lián)定位在第20號(hào)染色體上。leg1a和leg1b序列高度相似，編碼的蛋白結(jié)構(gòu)相同，都由N端信號(hào)肽和功能未知的DUF781結(jié)構(gòu)域組成通過(guò)對(duì)基因的表達(dá)分析證實(shí)在胚胎

3、期leg1a的表達(dá)占主導(dǎo)地位(占90％以上)；在成魚(yú)肝臟中l(wèi)eg1a仍為主表達(dá)基因，但leg1b表達(dá)大幅提高，legb的表達(dá)約占40％。本研究通過(guò)軟件預(yù)測(cè)結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)了Leg1是一個(gè)肝臟合成的新型的分泌蛋白，它在斑馬魚(yú)肝臟合成后隨著血液分布全身。在胚胎肝臟的發(fā)育中Leg1a與Leg1b功能都至關(guān)重要，它們的功能部分重疊但不完全相同。斑馬魚(yú)內(nèi)胚層器官特異探針的檢測(cè)結(jié)果顯示敲低Leg1的表達(dá)影響了肝臟的增長(zhǎng)而不是肝芽的起始萌發(fā)，同時(shí)也影

4、響了腸和外分泌胰腺的生長(zhǎng)發(fā)育。剔除信號(hào)肽的截短的Leg1蛋白不能夠拯救由MOATG morpholino引起的肝臟變小的表型，證明了信號(hào)肽的存在對(duì)Leg1的功能至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步分析了敲低Leg1表達(dá)引起肝臟變小的分子機(jī)制，包括通過(guò)PH3免疫組化和TUNEL實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了MOATGmorpholino肝臟細(xì)胞的增殖和凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Leg1功能的敲低引起肝臟變小的原因是由于肝臟細(xì)胞周期受到了抑制，而跟肝臟細(xì)胞的凋亡無(wú)關(guān)。
　

5、　 此外，本課題通過(guò)TILLING的方法，在ENU突變?nèi)后w中，篩選獲得了leg1a基因的兩個(gè)突變體c11和h11，這為以后剖析Leg1作為分泌蛋白在斑馬魚(yú)發(fā)育中的生理生化功能，特別是研究它在成魚(yú)中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還通過(guò)蛋白免疫共沉淀技術(shù)在尋找Leg1的互作蛋白方面進(jìn)行了一些有益的探索。
　　 綜合以上，我們推測(cè)Leg1很可能代表一類新型胞外信號(hào)因子，它在包括肝臟在內(nèi)的消化器官發(fā)育過(guò)程中可能扮演著重要角色。今后