新型分泌蛋白AKR1B10的分泌機制及其在乳腺癌分子診斷中的應用研究.pdf

1、醛酮還原酶家族1成員B10(Aldo-keto Reductase family1，memberB10，AKR1B10)，也叫醛糖還原酶相似蛋白1(Aldo-keto ReductaseLike-Protein，ARL-1)主要表達于正常人的結腸和小腸組織，而在肝、胸腺、前列腺、睪丸和骨骼肌等組織中表達低。AKR1B10一方面還原醛酮類羰基化合物為相應的醇類，保護DNA免于羰基毒性損傷和細胞免于癌變；另一方面AKR1B10穩(wěn)定乙酰輔酶A

2、羧化酶α(Acetyl-CoACarboxylase，ACCα)，阻止ACCα降解，從而調(diào)節(jié)脂質合成，促進腫瘤細胞生長增值。因此，AKR1B10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。AKR1B10在肝癌、肺癌、子宮頸癌等多種腫瘤細胞中高表達，是吸煙導致的非小細胞型肺癌的病理學診斷標記物。
　　 在本課題中，利用自行開發(fā)的ELISA檢測法(已申請專利保護：US13/017，618)，我們發(fā)現(xiàn)AKR1B10可從腫瘤細胞內(nèi)分泌到細胞外。這種分泌現(xiàn)

3、象不但發(fā)生在腸癌細胞株HCT-8、HT29，肺癌細胞株H460、A549，乳腺癌細胞株MDA-MB-468，BT-20，肝癌細胞株HepG2等表達內(nèi)源性AKR1B10的腫瘤細胞株和轉染外源性AKR1B10基因的MCF-7乳腺癌細胞株。血清可刺激細胞分泌AKR1B10，而且與透析過的血清相比，平臺期的高度無明顯變化，但達到平臺期的時間更短；這提示血清小分子(離子)決定了分泌的速度，而血清大分子決定了分泌的峰值。AKR1B10的分泌量與細胞

4、數(shù)目正相關，但單位細胞分泌量與細胞密度負相關。分泌的AKR1B10仍然保留著與等量純蛋白酶同樣的活性。
　　 本課題還深入研究了AKR1B10分泌的機制。通過信號肽分析軟件，我們發(fā)現(xiàn)AKR1B10的氨基酸序列缺少分泌信號肽，所以推測AKR1B10并不能通過經(jīng)典的內(nèi)質網(wǎng)-高爾基(ER-to-Golgi)分泌途徑分泌到細胞外的。AKR1B10的分泌不受蛋白翻譯抑制劑Cycloheximide(CHX)和ER-to-Golgi分泌途徑

5、抑制劑Brefeldin A的影響，說明分泌的AKR1B10是已經(jīng)合成的，而與正在翻譯合成的AKR1B10無關，也與ER到Golgi體之間的轉運無關。因此，AKR1B10的分泌途徑是非ER-to-Golgi依賴的非經(jīng)典途徑。
　　 溶酶體介導的分泌途徑是常見的非經(jīng)典分泌途徑。為了論證AKR1B10是否也是通過溶酶體途徑分泌的，我們分離了HCT-8細胞的溶酶體，發(fā)現(xiàn)AKR1B10存在溶酶體中；用熒光蛋白保護分析法發(fā)現(xiàn)，細胞被打孔劑

6、Digitonin和胰蛋白酶(Trypsin)處理后，胞漿內(nèi)絕大部分帶綠色熒光(EGFP)標記的游離AKR1B10被消化掉了，而剩下的點狀EGFP-AKR1B10可與溶酶體共定位。這說明AKR1B10存在于溶酶體。為了進一步論證AKR1B10的分泌與分泌型溶酶體出胞的關系，我們用影響溶酶體出胞的因素如溫度、ATP、鈣離子(Ca2+)等處理HCT-8細胞，發(fā)現(xiàn)溫度越高，AKR1B10分泌越多，溫度越低，分泌越少，4℃時，分泌幾乎停止；提供

7、能量的ATP能促進AKR1B10分泌；增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度也可促進AKR1B10的分泌，Ca2+跨膜轉運體Ionomycin則顯著地促進了AKR1B10的釋放。趨溶酶體藥氯化氨(MH4Cl)一方面可促進溶酶體出胞，另一方面可阻止蛋白進入溶酶體；因此，用NH4Cl預處理HCT-8細胞后，AKR1B10分泌減少了；而末預處理組，NH4Cl促進了AKR1B10的分泌。同時，我們發(fā)現(xiàn)AKR1B10的釋放與溶酶體標記物Cathepsin D的

8、釋放規(guī)律是一致的，這提示AKR1B10是通過溶酶體介導的非經(jīng)典途徑分泌的。分泌性溶酶體的出胞受調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度的信號通路所調(diào)節(jié)。AKR1B10的分泌受到這些通路中關鍵信號分子ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)抑制劑Exo-1、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)抑制劑U73122的抑制，受G蛋白激動劑GTPγS、G蛋白偶聯(lián)受體配體fMLP的刺激。進一步證明了AKR1B10的分

9、泌是通過分泌性溶酶體的出胞介導的。
　　 本課題接著探討了AKR1B10進入溶酶體的機制。我們用ATP結合盒超家族轉運蛋白(ATP-Binding cassette，ABC)的抑制劑4，4’-diisothiocyanatostilbene-2，2’-disulfonic acid(DIDS)和Glibenclamide(Glib)處理HCT-8細胞后，發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)AKR1B10含量顯著減少，分泌到細胞外的AKR1B10也相應減

10、少。提示溶酶體膜上ABC轉運體是轉運AKR1B10進入溶酶體的主要通道。
　　 本課題還證實了AKR1B10在體內(nèi)也是分泌蛋白。因為AKR1B10主要表達于腸道上皮，因此我們收集了11例正常人的回腸液，檢測了其中AKR1B10濃度，發(fā)現(xiàn)AKR1B10特異性表達于成熟的腸道上皮細胞，并分泌到腸腔，濃度為188.6～535.7ng/ml(average=298.1ng/ml，n=11)。
　　 本課題進一步探討了主要分布于胞

11、漿的AKR1B10轉運到溶酶體的機制。用免疫共沉淀(CoIP)和Pulldown法發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90α(HeatShock Protein90 alpha，HSP90α)可與AKR1B10相互作用。HSP90α抑制劑Geldanamycin(GA)顯著地抑制了HCT-8細胞AKR1B10的分泌，降低了HSP90α與AKR1B10的結合，減少了AKR1B10在溶酶體內(nèi)的聚集。
　　 非經(jīng)典分泌蛋白通常包含一個與分泌相關的功能域。因

12、此，我們研究了不同AKR1B10肽段的分泌效率，以及它們與HSP90α的結合情況。通過構建AKR1B10全長和不同肽段(N端的N1-39、N1-83、N1-142、N1-231以及C端的C204-261、C204-316)的表達載體GST/pGEX，并將它們分別轉染到293T細胞中；與全長AKR1B10的分泌效率相比，N端肽段(N1-231)不具有分泌功能；而C端肽段C204-261、C204-316的相對分泌效率可達74.2±3.0％

13、和81.5±5.5％。這提示介導AKR1B10分泌的功能域可能存在于C端肽段C204-261。接著，我們將螺旋10(氨基酸殘基233到240)上氨基酸殘基233K、236E和240K三個位點進行了單點或聯(lián)合突變；與野生型AKR1B10相比，233K/A、236E/A和240K/A單點突變型AKR1B10的分泌效率分別下降到59.2±2.1％、63.3±1.1％和46.9±3.1％；而兩點聯(lián)合突變型AKR1B10的分泌效率減少到了43.1

14、5±1.5％(K233A和E236A聯(lián)合突變)、33.30±1％(K233A和K240A聯(lián)合突變)和33.52±3.1％(E236A和K240A聯(lián)合突變)；三點突變型AKR1B10的分泌效率只有野生型的18.2±3.2％。免疫共沉淀實驗顯示，三點突變性AKR1B10喪失了結合HSP90α的能力；western blot分析表明，突變性AKR1B10在溶酶體內(nèi)的聚集顯著減少了。這些結果提示，螺旋10(aa233-240)通過與HSP90α

15、結合從而介導了AKR1B10的分泌；該螺旋中氨基酸位點233K、236E和240K是結合HSP90α的關鍵位點。
　　 最近，我們研究發(fā)現(xiàn)，AKR1B10在乳腺癌組織中過表達，可增加乳腺癌細胞的脂質合成，促進生長增值，抑制醛酮類羰基化合物誘導的凋亡；AKR1B10高表達與乳腺癌的生長、淋巴結轉移和存活率相關，提示AKR1B10是一個新的乳腺癌預測指標。因此，本課題探討了開發(fā)AKR1B10為診斷乳腺癌的血清學指標的可行性。通過對乳

16、腺癌組織芯片進行免疫染色發(fā)現(xiàn)，正常乳腺小葉和乳腺管低表達或不表達AKR1B10；而在28例原位乳腺管癌中，有20例(71.4％)AKR1B10高表達；在220例乳腺浸潤癌中有184(83.6％)AKR1B10高表達；在32例術后復發(fā)乳腺癌中有28例AKR1B10高表達。此外，我們檢測了50例乳腺癌患者腫瘤組織中AKR1B10的表達和血液中AKR1B10的含量，發(fā)現(xiàn)48例乳腺癌組織中的AKR1B10表達水平要顯著高于癌旁正常組織的；血清中