下調(diào)乙酰輔酶A羧化酶2調(diào)節(jié)自噬可改善棕櫚酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞脂毒性.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic nephropathy， DN)是糖尿病的并發(fā)癥之一，它已經(jīng)成為引起終末期腎病(end-stage renal disease ESRD)的主要原因。在非脂肪組織中，脂質(zhì)超負(fù)荷會(huì)使循壞和胞質(zhì)中的脂質(zhì)分解和合成平衡紊亂，發(fā)生了脂質(zhì)的異常堆積，這被稱之為脂毒性。研究證明脂毒性與很多代謝綜合征的病理生理學(xué)機(jī)制相關(guān)，特別是2型糖尿病(T2DN)及其并發(fā)癥。β-氧化是脂肪酸分解代謝的主要途徑且為腎臟ATP產(chǎn)生的

2、主要來(lái)源。乙酰輔酶A羧化酶2（Acetyl-CoA carboxylase2，ACC2）是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶并催化乙酰輔酶A羧化為丙二酰輔酶A，而丙二酰輔酶A是脂肪酸氧化的一個(gè)關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，通過(guò)抑制肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)來(lái)限制脂肪酸β氧化，是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶。自噬因能控制細(xì)胞能量平衡而被熟知。但是自噬與脂肪酸β氧化兩者相互間的關(guān)系仍然未知。本研究旨在探討:ACC2在棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞

3、脂毒性中的作用和自噬在這個(gè)過(guò)程中可能起到的作用。
　　方法：⑴用300uM棕櫚酸處理HK2細(xì)胞特定的時(shí)間，并以BSA作為對(duì)照組。用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積。用CCK-8來(lái)觀察細(xì)胞活性。用PI染色來(lái)觀察細(xì)胞死亡情況。⑵用qPCR的方法觀察:棕櫚酸及BSA分別刺激HK2細(xì)胞后ACC2的mRNA水平。用免疫組化的方法觀察:高脂喂養(yǎng)的大鼠與正常喂養(yǎng)大鼠ACC2和pACC2的表達(dá)水平。⑶使用shRNA慢病毒感染HK2細(xì)胞使ACC2的表

4、達(dá)發(fā)生變化，并用Wesrern Blot方法來(lái)驗(yàn)證敲除效率，之后用300 uM PA處理轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞72小時(shí)。用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積。用CCK-8來(lái)觀察細(xì)胞活性。⑷PA處理HK2細(xì)胞后觀察自噬表達(dá)水平。不同濃度PA刺激HK2細(xì)胞2小時(shí)后，用Western blotting檢測(cè)LC3，Beclin-1 and p62，用透射電鏡以及mRFP-GFP-LC3腺病毒干擾的方法檢測(cè)HK2細(xì)胞的自噬情況。⑸用Western Blot、

5、RT-qPCR及免疫組化的方法檢測(cè)高脂飲食大鼠以及正常喂養(yǎng)大鼠體內(nèi)LC3，Beclin-1和p62的表達(dá)水平。⑹改變?chǔ)?氧化后觀察自噬改變情況。分別用ACC2kd(ACC2 shRNAknockdown，ACC2kd)細(xì)胞及80 uM Etomoxir處理HK2細(xì)胞后觀察自噬。用Western Blot檢測(cè)LC3，Beclin-1和p62蛋白水平。用LC3免疫熒光的共聚焦顯微鏡來(lái)觀察各組自噬的改變情況。⑺使用Atg5 siRNA感染HK

6、2細(xì)胞，使Atg5表達(dá)降低，并用Wesrem Blot方法驗(yàn)證敲除效率。分別用PA刺激ACC2KD的HK2細(xì)胞、Atg5KD的HK2細(xì)胞以及兩者共同敲除的HK2細(xì)胞，使用CCK8的方法觀察細(xì)胞活性。
　　結(jié)果：①在PA刺激24h觀察到HK2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。細(xì)胞活性在PA處理（P＜0.05）后48小時(shí)下降明顯，72小時(shí)進(jìn)一步降低。PA刺激HK2細(xì)胞死亡明顯。②用qPCR檢測(cè)PA刺激HK2細(xì)胞，ACC2的

7、mRNA(P＜0.05)水平比正常HK2細(xì)胞明顯增高。高脂喂養(yǎng)大鼠相比正常喂養(yǎng)大鼠，前者ACC2表達(dá)升高且pACC2表達(dá)明顯降低。③ACC2kd細(xì)胞在PA刺激72小時(shí)后脂質(zhì)沉積明顯減少且細(xì)胞活性（P＜0.05）較單純PA刺激的HK2細(xì)胞也有明顯改善。④檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62蛋白表達(dá)均表明:PA刺激HK2細(xì)胞時(shí)，自噬從最低濃度100 uM PA刺激時(shí)被激活，并呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)。透射電鏡及mRFP-GF

8、P-LC3的腺病毒感染也得出相同結(jié)論。⑤無(wú)論在蛋白水平還是mRNA水平，高脂喂養(yǎng)大鼠相比正常喂養(yǎng)大鼠，自噬都被激活。⑥ACC2kd細(xì)胞降低了PA刺激后自噬(P＜0.05)的水平。⑦PA刺激HK2細(xì)胞，ACC2或Atg5基因沉默組HK2細(xì)胞活性與單純PA刺激的細(xì)胞相比，基因沉默組細(xì)胞活性有所恢復(fù)，但是雙基因的沉默并沒有使細(xì)胞活性有更加顯著的恢復(fù)。
　　結(jié)論：在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中脂質(zhì)代謝功能障礙時(shí)自噬被激活。體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)下調(diào)乙酰輔酶A