H2S和CAS調(diào)控番茄果實(shí)采后抗氧化信號(hào)機(jī)制及CAS功能研究.pdf

1、中國(guó)的果蔬種植面積大，是果蔬生產(chǎn)和消耗的大國(guó)。目前中國(guó)果實(shí)采摘后的損失率高達(dá)20％-25％，因此，采后果蔬成熟衰老的機(jī)制研究具有重要的意義。在果蔬的采后成熟衰老過(guò)程中會(huì)有大量活性氧(ROS)的迸發(fā)，此時(shí)需要去除活性氧，植物中的抗氧化系統(tǒng)啟動(dòng)，保護(hù)植物組織免受ROS的傷害。植物激素乙烯(C2H4)在果實(shí)成熟衰老過(guò)程中也起著重要的調(diào)控作用，能夠促進(jìn)果實(shí)的成熟衰老和ROS的產(chǎn)生。硫化氫(H2S)近年來(lái)被認(rèn)為是一種重要的氣體信號(hào)分子，它參與植物

2、的硫代謝通路，能夠延緩果蔬的成熟衰老，同時(shí)可以抑制ROS的產(chǎn)生，增強(qiáng)果實(shí)的抗氧化能力。在C2H4代謝的后期會(huì)產(chǎn)生氰化物，氰丙氨酸合成酶(Cyanoalanine synthase，CAS)在解氰的同時(shí)生成H2S。除此之外，在植物受到外界脅迫時(shí)，CAS也起到了保護(hù)植物體免受傷害的作用。目前，H2S延緩植物衰老的研究很多，然而是否與乙烯拮抗，延緩番茄果實(shí)采后成熟衰老尚未報(bào)道，同時(shí)，CAS作為解氰作用的關(guān)鍵酶，也是內(nèi)源H2S產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，其在

3、果實(shí)成熟衰老過(guò)程中的作用尚不清楚。本論文以破色期小番茄果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，用H2S氣體的供體硫氫化鈉(NaHS)和C2H4氣體的供體乙烯利，研究外源H2S和C2H4對(duì)采后小番茄成熟衰老的影響，并通過(guò)篩選CAS基因編輯和過(guò)表達(dá)番茄植株，探索CAS的功能。
　　本文研究了H2S和C2H4對(duì)小番茄采后的成熟衰老過(guò)程中與抗氧化代謝的關(guān)系。研究表明，與H2S+C2H4共同處理相比較，H2S可以降低超氧根陰離子(·O2-)產(chǎn)生速率，抑制過(guò)氧化氫

4、(H2O2)和丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，增強(qiáng)番茄果實(shí)中過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，抑制番茄果實(shí)中脂氧合酶(LOX)和多酚氧化酶(PPO)活性，以及在貯藏后期上調(diào)苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。相反，C2H4加速ROS的產(chǎn)生，抑制抗氧化酶的活性。因此，H2S在番茄成熟過(guò)程中能夠起到減少果實(shí)自由基積累，維持細(xì)胞ROS的代謝平衡，提高番茄果實(shí)的抗氧化能力，延緩其

5、采后的成熟與衰老。
　　本文還從基因水平上研究了H2S和C2H4在番茄采后成熟衰老過(guò)程中與抗氧化酶基因和CAS家族相關(guān)酶基因的關(guān)系。研究表明，與H2S+C2H4共同處理相比較，H2S在番茄的整個(gè)貯藏期能夠上調(diào)抗氧化酶調(diào)控基因APX3、CAT1、CAT2、POD3、FeSOD、CuZnSOD，在貯藏前期上調(diào)APX2、CAT3，在貯藏后期上調(diào)SOD1、SOD2，提高抗氧化酶的基因的表達(dá)，延緩番茄果實(shí)的成熟衰老，同時(shí)促進(jìn)CAS家族基因C

6、AS1、CAS2以及其下游通路關(guān)鍵基因NIT4B的表達(dá)，說(shuō)明H2S處理減輕了果實(shí)成熟過(guò)程中HCN帶來(lái)的傷害作用。且CAS、H2S和抗氧化之間有著極其密切的聯(lián)系。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)CAS進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明CAS1和CAS2基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)都可能位于葉綠體和線粒體中，之后通過(guò)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)觀察驗(yàn)證結(jié)果;番茄CAS1和CAS2基因同源性有82.1％，其中CAS1基因與馬鈴薯同源性高達(dá)99％。CAS2基因與美花煙草的同源性達(dá)到

7、86.2％;CAS1和CAS2均具有1個(gè)結(jié)構(gòu)域且沒(méi)有跨膜區(qū)域存在。
　　本文還以Microtom番茄為材料，構(gòu)建了CAS基因編輯突變體和過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)篩選和鑒定獲得T0代番茄植株，利用其愈傷組織分析CAS家族基因在抗逆中的應(yīng)答機(jī)制。結(jié)果表明，CAS1和CAS2基因表達(dá)模式并不相同，在應(yīng)對(duì)干旱和高鹽脅迫時(shí)，CAS1基因受到的誘導(dǎo)更為強(qiáng)烈。在干旱脅迫下，與WT相比，CAS1基因敲除植株愈傷組織能夠加快褐化，同時(shí)含水量減少，細(xì)胞膜滲透

8、率升高，細(xì)胞膜的完整性受到破壞，CAS1敲除植株愈傷組織SISGN-213276、SIAREB1、SIDREB、SIDREB1基因表達(dá)量下降，OECAS1植株愈傷組織SISGN-213276、SIAREB1、SIDREB、SIDREB1、SIUSP基因表達(dá)量上升，CAS1可能是通過(guò)調(diào)控干旱相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抵抗干旱的脅迫。在高鹽脅迫下，與WT相比，CAS1基因敲除植株愈傷組織在外觀上并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)脅迫的敏感性，但是在脅迫下其含水量和細(xì)胞膜