重組雙功能水蛭素體內(nèi)分析方法研究及在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用.pdf

1、水蛭素是存在于水蛭唾液中的最為重要的一種活性成分,是一種直接凝血酶抑制劑,能與凝血酶直接結(jié)合,抑制凝血酶的活性,產(chǎn)生抗凝作用,是臨床上一種安全有效的治療血栓的藥物。
　　 2003年,復(fù)旦大學(xué)教育部分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室成功地將具有抗血小板集聚活性的(RGD)編碼順序與水蛭素的cDNA相融合,構(gòu)建了含有RGD編碼順序的雙功能水蛭素cDNA克隆,經(jīng)過發(fā)酵,分離和純化后獲得了具有抗凝血酶和抗血小板集聚雙重功能的重組雙功能水蛭素(r-RG

2、D-Hirudin,BifunctionalHirudirt,BFH)。
　　 本課題對重組雙功能水蛭素體內(nèi)分析方法進(jìn)行了研究,建立了液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)用于人血中重組雙功能水蛭素的濃度測定,和毛細(xì)管電泳一質(zhì)譜聯(lián)用法(CE-MS)用于人尿中重組雙功能水蛭素的濃度測定。兩種方法的突出優(yōu)點(diǎn)在于通過樣品前處理技術(shù)的改進(jìn)(LC-MS)和在線柱上濃集技術(shù)的改進(jìn)(CE-MS)使方法靈敏度得到極大的改善。目前,這兩種方法已經(jīng)成功

3、應(yīng)用于重組雙功能水蛭素的一期臨床耐受性試驗(yàn)中。
　　 LC-MS法中采用了超濾配合冷凍干燥技術(shù),分離和濃集血清樣品中的重組雙功能水蛭素分子,克服了通常的血樣前處理技術(shù)對于水溶性蛋白類藥物無能為力的難點(diǎn),在樣品前處理方面具有創(chuàng)新性。LC-MS法作為一種水蛭素的直接測定方法,簡便易行、數(shù)據(jù)可靠,相比文獻(xiàn)報(bào)道的各類直接和間接測定法在方法學(xué)的各個(gè)方面都具有優(yōu)勢。在一期臨床耐受性試驗(yàn)中,按照盲樣程序成功地對4個(gè)不同劑量組志愿者血清中的重組

4、雙功能水蛭素濃度進(jìn)行了測定,并且和常規(guī)的血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果作了比較。結(jié)果顯示,本課題所建立的LC-MS法,最低定量濃度達(dá)到25ng/mL,完全能夠滿足對血中重組雙功能水蛭素濃度測定的要求,為其進(jìn)一步獲得其人體藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及相關(guān)的臨床試驗(yàn)研究提供了有力的手段和技術(shù)保證。
　　 CE-MS法中采用了毛細(xì)管在線柱上濃集技術(shù)(動(dòng)態(tài)pH接界),在不需要對尿樣進(jìn)行前處理,也無需對硬件設(shè)備進(jìn)行提升的情況下,即可克服CE方法由于進(jìn)樣量少而造成的