重組水蛭素在大鼠體內(nèi)的生物分析及其藥代動力學(xué)研究.pdf

1、隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組多肽類藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療實踐。這類藥物的新藥開發(fā)及臨床合理應(yīng)用必須首先闡明其藥代動力學(xué)（Pharmacokinetics，PK）特點.。然而，多肽類藥物PK研究一直是藥物PK研究中的一大難點。本文針對這一難點問題進(jìn)行了深入的研究。首先通過對凝血酶特異性抑制劑重組水蛭素(Recombinan tHirudin，rH) PK研究，建立多肽類藥物PK研究的通用方法和適用于rH PK研究的個性方法;其次通過對

2、rH在大鼠尿中代謝產(chǎn)物的分析建立多肽類藥物在動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物研究的通用方法，同時研究rH在大鼠體內(nèi)的代謝過程和代謝產(chǎn)物，為國產(chǎn)rH的研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法1、建立一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)技術(shù)，測定國產(chǎn)rH(N-Ile1-Thr-63-脫硫酸基-r-重組水蛭素)在大鼠血漿等生物樣品中的濃度/含量，并全面研究靜脈注射給藥(intrav

3、enousinjection，iv)rH后，rH在大鼠體內(nèi)的PK和組織分布;2、根據(jù)rH具有抗凝血酶的生物特性，建立用生色底物法測定rH在大鼠血漿和尿中的濃度，并研究iv給予大鼠后，rH在大鼠血漿的PK及尿排泄;3、用125I標(biāo)記rH得125I-rH，iv給予大鼠后，研究125I-rH在大鼠體內(nèi)的PK，并同時研究rH在大鼠體內(nèi)的代謝過程;4、將凝膠色譜和γ-計數(shù)儀相結(jié)合，通過測定血漿和尿中的放射性活性，研究rH在大鼠血漿中的代謝過程以及

4、尿中的代謝產(chǎn)物，用凝膠色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)對尿中代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，采用飛行時間質(zhì)譜以及氨基酸序列測定儀分析其代謝產(chǎn)物的分子量和結(jié)構(gòu)序列。
　　實驗結(jié)果1、ELISA法能有效的測定大鼠體液和組織中rH的濃度/含量，最低檢出量為0.25 ng·mL-1，樣品濃度在0.25 ng·mL-1-3.0 ng·mL-1之間線性關(guān)系良好(r=0.999)。其血藥濃度用3p97程序軟件擬合，均符合開放二室模型一級動力學(xué)過程

5、。靜脈注射rH劑量為0.5、1.0、2.0 mg·kg-1時其各劑量主要動力學(xué)參數(shù)分別為:t1/2α(min):6.408±2.603，5.568±1.106，5.695±0.682; t1/2β(min):47.28±13.14，45.41±6.207，46.82±5.562; AUC(μg·mL-1×min):127.8±27.81，330.8±115.92，575.2±39.42。除AUC外，各濃度間的藥代動力學(xué)參數(shù)均很接近，經(jīng)統(tǒng)

6、計處理無顯著差異(P＞0.05)，其中t1/2α為5-6 min，說明藥物自中央室向外周室分布很快;t1/2β為45-47 min，說明藥物從血漿中消除也較快。三種劑量的AUC與劑量成正比（經(jīng)回歸計算r=0.991），說明在此范圍內(nèi)，藥物在大鼠體內(nèi)的消除為線性動力學(xué)。靜脈注射給藥1.0 mg·kg-1，大鼠尿、糞便和膽汁中幾乎檢測不到原型的rH。組織分布實驗表明，iv1.0 mg·kg-1，呈快速分布，15分鐘各組織中藥物含量最高;以后

7、逐漸減少。15分鐘各組織分布以肺部含量最高為78.88±32.30 ng·g-1，1h以腎臟含量最高，為24.39±39.7 ng·g-1;3 h以肝臟含量最高，僅為7.55±11.33 ng·g-1。2、生色底物法能有效的測定大鼠血漿中rH的含量，rH的濃度在3.125-40 ng·mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(r=-0.995)。用該方法研究iv給藥rH2.0 mg·kg-1大鼠血漿藥動學(xué)，除AUC外，其它藥動學(xué)參數(shù)均與ELISA法一致

8、;生色底物法能有效的測定大鼠尿中rH的含量，rH在6.25-75 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(r=-0.997)。用該方法研究大鼠iv0.5、1.0和2.0 mg·kg-1 rH后尿藥濃度及排泄動力學(xué)，0-12h的累積排泄率為分別給藥量的22.30％、23.23％和23.29％，不隨劑量改變而顯著改變，表明rH在體內(nèi)遵循一級線性動力學(xué)方式從尿中排泄。3、同位素示蹤法研究125I-rH在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)結(jié)果顯示，rH在大鼠體內(nèi)的消

9、除半衰期t1/2β(min)為701.9±198.0(RA)和724.9±81.2(TCA-RA);按總放射性活性計算，0-12h累計排泄率為給藥量的62.1％，96 h累計排泄率為給藥量的90.8％。4、rH在血漿中被代謝，經(jīng)由尿中排泄;其代謝產(chǎn)物具有抗凝血酶的生物活性，其中抗凝血酶活性最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物的分子量為5162 Da，由51-52個氨基酸組成。
　　結(jié)論1、用ELISA法和生色底物法測定給藥后大鼠生物樣品中rH濃度/含量

10、，經(jīng)方法學(xué)驗證表明靈敏度高、特異性強(qiáng)，符合多肽類藥物藥動學(xué)研究要求。用于rH的PK研究表明，國產(chǎn)rH在大鼠體內(nèi)的PK行為符合開放二室模型一級動力學(xué)過程，其體內(nèi)消除快速（半衰期在46 min左右）。2、用同位素示蹤法研究rH在大鼠體內(nèi)的PK所得到的PK參數(shù)與所建立的ELISA以及生色底物法所得到的PK參數(shù)之間差異很大，很可能由于同位素示蹤法缺乏選擇性所致，提示這種方法不宜用于rH以及相關(guān)多肽PK研究。3、rH在大鼠體內(nèi)經(jīng)受廣泛的代謝降解，