碳酸酐酶IV在胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、一、目的：
　　胃癌是全球死亡率極高的惡性腫瘤之一，而我國(guó)正是胃癌高發(fā)地區(qū)。由于作用因素復(fù)雜，胃癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分明了。目前已有研究表明碳酸酐酶家族(carbonic anhydrases，CAs)在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色，其中碳酸酐酶IV(carbonic anhydrase IV，CA4)在腸癌中就是通過(guò)靶向WTAP–WT1–TBL1抑制Wnt通路而發(fā)揮抑癌效應(yīng)。鑒于此，本論文以胃癌作為研究對(duì)象，收集臨床樣

2、本并采用多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，希望闡明CA4在胃癌發(fā)生中所發(fā)揮的生物學(xué)功能，為胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　二、方法：
　　1.采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（real-time reverse transcription-PCR，qRT-PCR）和蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blot，WB）檢測(cè)CA4是否在胃癌及癌旁組織和胃正常細(xì)胞株GES-1及癌細(xì)胞株AGS中是否存在差異性表達(dá)。
　　2.采用焦磷酸測(cè)

3、序技術(shù)檢測(cè)GES-1和AGS中CA4基因甲基化狀態(tài)。
　　3.構(gòu)建CA4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至GES-1和AGS細(xì)胞中，然后分別采用流式細(xì)胞儀（flow cytometer）、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（Real-Time Cell Analyzer，RTCA）和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期和增殖的變化。
　　4.上調(diào) CA4在 GES-1和 AGS細(xì)胞中的表達(dá)后，應(yīng)用 WB檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK2表達(dá)水平。
　　三、結(jié)果：

4、>　　1.相對(duì)于癌旁組織和胃正常粘膜細(xì)胞株 GES-1，胃癌癌組織標(biāo)本和癌細(xì)胞株AGS均呈低表達(dá)。
　　2. AGS細(xì)胞CA4基因CpG島甲基化率高于GES-1。
　　3.上調(diào)CA4在GES-1和AGS細(xì)胞中的表達(dá)即可抑制細(xì)胞增殖也可阻滯細(xì)胞周期。
　　4.過(guò)表達(dá)CA4可以抑制GES-1和AGS細(xì)胞中CDK2的表達(dá)。
　　四、結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與胃癌癌旁組織和正常胃粘膜細(xì)胞相比，胃癌癌組織和癌細(xì)胞