碳酸酐酶IX在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景:
　　胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，全球每年約有70萬(wàn)例患者死亡。胃癌的發(fā)病經(jīng)過(guò)多個(gè)過(guò)程，腸上皮化生及不典型增生是胃癌的癌前病變。多種遺傳及表觀遺傳變化參與惡變及癌癥進(jìn)展過(guò)程，但其分子生物學(xué)基礎(chǔ)仍不明確。因此，胃癌的診斷、治療及預(yù)防需要研究發(fā)現(xiàn)新的分子生物學(xué)靶標(biāo)。
　　碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)是由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，是一種含Zn酶，可參與CO2轉(zhuǎn)化成H+與HCO3-的可逆反應(yīng)，從而

2、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的PH。最初，CAIX被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)基因，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中起重要作用。CAIX在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)，但在腫瘤組織中高表達(dá)，并有著致癌活性。不過(guò)，在胃癌組織，CAIX高表達(dá)在正常胃粘膜，而在胃癌中被下調(diào)。胃癌中CAIX的分子生物學(xué)機(jī)制可能與其它癌癥不同。關(guān)于CAIX在胃癌中的作用仍有爭(zhēng)議，需要充分探討。
　　目的:
　　闡明CAIX在胃癌發(fā)病機(jī)制中的重要作用,探討相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路及分子生物學(xué)機(jī)制。

3、　　方法：
　　1.應(yīng)用reverse transcriptional PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)22種胃癌細(xì)胞中CAIX mRNA的表達(dá)情況。7種胃癌細(xì)胞中CAIX蛋白質(zhì)的表達(dá)用western blot analysis進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.利用methylation specific PCR（MSP）方法在22種胃癌細(xì)胞株、39例癌旁正常胃粘膜、2例腸上皮化生、9例不典型增生及33例胃癌組織中檢測(cè)CAIX啟動(dòng)子的甲基化

4、。
　　3.為進(jìn)一步驗(yàn)證MSP結(jié)果,對(duì)5種胃癌細(xì)胞株、7對(duì)正常胃粘膜組織及胃癌組織進(jìn)行bisulfite genomic sequencing(BGS)檢測(cè)。
　　4.為了研究CAIX的下調(diào)與甲基化的相關(guān)性，胃癌細(xì)胞用5-Aza-2’-Deoxycitidine(5-Aza) and Trichostatin A(TSA)進(jìn)行處理，再用RT-PCR檢測(cè)CAIX的表達(dá)重現(xiàn)與否。
　　5.為檢測(cè)CAIX高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生物

5、學(xué)行為的影響，建立CAIX高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株(Mock-AGS，CAIX-AGS，Mock-MKN1 and CAIX-MKN1)。為了檢測(cè)CAIX高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，對(duì)CAIX高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行July stage anaylsis、劃痕試驗(yàn)和transwell analysis。
　　6.對(duì)CAIX高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行xenograft analysis,觀察CAIX高表達(dá)對(duì)腫瘤發(fā)生的影響。
　　7.

6、對(duì)CAIX高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株及GeneChip Human Gene1.0 ST Array X4進(jìn)行cDNA microarray analysis，探討相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　8.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)103例胃癌患者組織中CAIX的蛋白表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床特征進(jìn)行分析，探討CAIX在胃癌中的臨床意義。
　　結(jié)果：
　　1.22種胃癌細(xì)胞株中有7種細(xì)胞株呈現(xiàn)CAIX mRNA的表達(dá)，并且在7種胃癌細(xì)胞株中有1種胃

7、癌細(xì)胞株呈現(xiàn)CAIX蛋白表達(dá)。
　　2.19(86.4％),2(9.1%)及1(4.5%)種胃癌細(xì)胞株分別呈現(xiàn)出CAIX啟動(dòng)子的full methylation，unmethylation and partial methylation。癌旁正常胃粘膜、腸上皮化生、不典型增生及胃癌組織中也可頻繁觀察到CAIX啟動(dòng)子的甲基化。
　　3.BGS結(jié)果表明，胃癌組織的甲基化程度與正常組織的相比顯著增高(P<0.001)。
　　

8、4.5-Aza處理胃癌細(xì)胞可使CAIX的表達(dá)重現(xiàn)。
　　5.CAIX高表達(dá)可下調(diào)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲(P<0.001,P<0.001)。
　　6.CAIX高表達(dá)可抑制腫瘤的形成(P<0.05)。
　　7.應(yīng)用cDNA microarray篩選出了77個(gè)CAIX高表達(dá)相關(guān)候選基因組。
　　8.無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者相比，CAIX的表達(dá)在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯著升高(P<0.05)，并且無(wú)CAI