轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的泛素化修飾.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)錄因子Oct4的泛素化修飾姓名：廖兵申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：金穎20050501學(xué)位論文：轉(zhuǎn)錄因子Oct4的泛索化修飾摘要轉(zhuǎn)錄因子Oct一4由基因Pou5fl編碼，也被稱為Oct3，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程起著非常重要的作用。Oct4缺失的小鼠胚胎不能形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，導(dǎo)致胚胎在囊胚期死亡。Oct4特異表達(dá)于小鼠胚胎發(fā)育過程中的多能和全能性細(xì)胞，在胚胎干細(xì)胞、胚胎腫瘤細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)

2、胞等未分化的體外培養(yǎng)細(xì)胞中也有高表達(dá)，而在分化的成體細(xì)胞中不表達(dá)。說明Oct4是維持細(xì)胞全能性的關(guān)鍵因子。但是，目前還不清楚調(diào)控Oct，4的表達(dá)和功能的分子機(jī)制。眾所周知，體內(nèi)蛋白質(zhì)經(jīng)常是通過蛋白質(zhì)之間的相互作用或形成蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用。近幾年的研究表明，Oct4能與一些轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子相互作用調(diào)節(jié)胚胎早期發(fā)育。因此，尋找與Oct一4相互作用的蛋白質(zhì)是揭示胚胎干細(xì)胞維持發(fā)育全能性的分子機(jī)制的重要突破口。我們實(shí)驗(yàn)室在利用GSTOct一4融合蛋

3、白親和層析尋找與Oct4相互作用的蛋白質(zhì)過程中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與Oct一4相互作用的新蛋白一小鼠蛋白Wwp2。我們證明Wwp2是一個(gè)含HECT功能域的E3泛素連接酶，在體外和體內(nèi)條件下，它都能促進(jìn)Oct4的泛素化修飾。如果突變Wwp2的活性位點(diǎn)，Wwp2就失去連接酶活性，不能促進(jìn)Oct一4的泛素化修飾。在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)wp2、Oct4與HisUb的表達(dá)質(zhì)粒，Oct4的泛素化修飾顯著增強(qiáng)，然后泛素化的Oct4經(jīng)26S蛋白酶體降解。

4、這種降解能被蛋白酶體抑制劑(如MGl32)阻斷。在Oct4的N端融合一個(gè)泛素分子，呈劑量依賴性地抑制Oct4的轉(zhuǎn)錄活性。HEK293細(xì)胞中，過表達(dá)Wwp2也顯示劑量依賴地抑制Oct4的轉(zhuǎn)錄活性。而且，在胚胎干細(xì)胞中過表達(dá)Wwp2同樣抑制了內(nèi)源性O(shè)ct4的轉(zhuǎn)錄活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Wwp2很有可能是通過促進(jìn)Oct4的泛素化修飾來抑制Oct4的轉(zhuǎn)錄活性。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了Oct一4的泛素化修飾，Wwp2是其特異的E3泛素連接酶。泛素化的O