肝膽腫瘤細(xì)胞中Survivin和Oct-4基因表達(dá)相關(guān)性及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的
　　細(xì)胞凋亡是所有組織用來去除受損或多余細(xì)胞的必要生理過程。在對(duì)惡性腫瘤的深入研究中，人們發(fā)現(xiàn)正常上皮細(xì)胞的存活需要細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的支持并給予存活信號(hào)。若上皮細(xì)胞脫離了ECM，細(xì)胞則會(huì)發(fā)生凋亡，這種形式的凋亡被稱為失巢凋亡(Anoikis)。上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因是由于遷移的過程中喪失了失巢凋亡(Anoikis)的特性。正是這一特性的喪失，使脫離了實(shí)體腫瘤的惡性細(xì)胞逃脫了發(fā)生凋亡的命運(yùn)而繼續(xù)存活

2、，并進(jìn)一步發(fā)生遷徙、浸潤(rùn)，形成轉(zhuǎn)移瘤和異位癌。這一過程與胚胎著床發(fā)育的過程極其相似，發(fā)生這一現(xiàn)象的腫瘤細(xì)胞在一定程度上具有了與干細(xì)胞類似的某些生物學(xué)特性。
　　干細(xì)胞特異性基因Oct-4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族，在維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化過程起著關(guān)鍵性作用。胚胎形成過程中，一旦Oct-4基因表達(dá)異常，就會(huì)影響胚泡內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)發(fā)育，最終導(dǎo)致胚胎死亡。體外培養(yǎng)的細(xì)胞，通過單一因子Oct-4基因的誘導(dǎo)表達(dá)，已成功轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄苄?/p>

3、干細(xì)胞。同時(shí)，Oct-4基因在多種惡性腫瘤的起源中起著一定作用。將Oct-4基因?qū)?T3細(xì)胞后，可以使部分細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，并且Oct-4基因可能通過激活和上調(diào)其下游靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。
　　Survivin，凋亡抑制蛋白家族（IAP）的一員，能夠結(jié)合凋亡效應(yīng)蛋白caspases并調(diào)節(jié)其功能，從而阻斷凋亡過程。它在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡的平衡中起著重要的調(diào)控作用，也是生殖細(xì)胞產(chǎn)生與增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)過程中基質(zhì)黏附、新

4、血管生成、上調(diào)原癌基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因素，已成為靶向腫瘤基因治療的重要目標(biāo)之一。
　　現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)：敲除survivin基因可導(dǎo)致妊娠4～5天后的小鼠胚胎死亡。在降低小鼠胚胎細(xì)胞OCT-4表達(dá)時(shí)，Survivin基因啟動(dòng)子的活性會(huì)顯著下降。而在腫瘤細(xì)胞株中Survinvin和Oct-4之間的是否存在同樣關(guān)系尚未有報(bào)道。本課題基于此，著重探討腫瘤細(xì)胞中Survinvin和Oct-4基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法與結(jié)果
　

5、　本課題分為以下幾部分研究?jī)?nèi)容：
　　研究一：腺病毒重組質(zhì)粒pSurv-shRNA的構(gòu)建
　　方法：在腺病毒載體的基礎(chǔ)上，引入Survivin基因啟動(dòng)子，構(gòu)建的腺病毒shRNA載體，測(cè)序正確后，用293T細(xì)胞進(jìn)行重組，TCID50法測(cè)定病毒滴度。
　　結(jié)果：重組腺病毒質(zhì)粒pSurv-shRNA經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確，重組病毒滴度達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求。
　　研究二：肝膽腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)對(duì)Survivin抗

6、凋亡作用的調(diào)控研究
　　方法：對(duì)臨床原發(fā)性肝癌、膽囊癌、膽管癌標(biāo)本Oct-4和Survivin的表達(dá)進(jìn)行免疫組化鑒定；進(jìn)一步建立肝癌、膽囊癌、膽管癌細(xì)胞系EHBH-H1、EH-GB1和EH-CA1，利用腺病毒攜帶Survivin-shRNA或Oct-4基因感染癌細(xì)胞系，利用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化，探討轉(zhuǎn)錄因子Oct-4與Survivin之間的相互調(diào)控及對(duì)癌細(xì)胞遺傳特性的影響。
　　結(jié)果：臨床原發(fā)性肝癌、膽囊癌

7、、膽管癌標(biāo)本Oct-4陽(yáng)性率達(dá)60.7％，Survivin陽(yáng)性率達(dá)75.0%，且兩者之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系；特異性shRNA沉默EH-CA1癌細(xì)胞Survivin表達(dá)后，其Oct-4表達(dá)沒有變化，但誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生阻滯和細(xì)胞凋亡；EH-GB1癌細(xì)胞獲得Oct-4表達(dá)后，Survivin表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞周期運(yùn)行并下調(diào)細(xì)胞凋亡。
　　研究三：針對(duì)Oct-4和Survivin基因的雙靶向shRNA腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑

8、制作用研究
　　方法：根據(jù)GenBankNM001168的Survivin基因序列和DQ486513.1的OCT-4基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA。酶切回收目的片段，插入到含有腺病毒同源序列和綠色熒光蛋白（EGFP）基因表達(dá)盒序列的載體質(zhì)粒pAd-EGFP中，并構(gòu)建含雙靶向shRNA的載體pDual-shRNA。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞得到重組腺病毒，鑒定正確后，擴(kuò)增、純化腺病毒，利用腺病毒攜帶特異性shRNA感染肝癌細(xì)胞系EHB

9、H-H1，通過Westernblotting、MTT和裸鼠荷瘤試驗(yàn)檢測(cè)Oct-4和Survivin基因的表達(dá)情況及瘤體體積變化。
　　結(jié)果：酶切、測(cè)序證實(shí)特異性shRNA腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。荷瘤試驗(yàn)顯示有明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（P<0.01）。
　　結(jié)論
　　1、Oct-4可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞Survivin的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行、抑制細(xì)胞凋亡的作用；
　　2、利用Oct-4調(diào)節(jié)Survivin啟動(dòng)子的