2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景與目的
  細(xì)胞凋亡是所有組織用來去除受損或多余細(xì)胞的必要生理過程。在對惡性腫瘤的深入研究中,人們發(fā)現(xiàn)正常上皮細(xì)胞的存活需要細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的支持并給予存活信號。若上皮細(xì)胞脫離了ECM,細(xì)胞則會發(fā)生凋亡,這種形式的凋亡被稱為失巢凋亡(Anoikis)。上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因是由于遷移的過程中喪失了失巢凋亡(Anoikis)的特性。正是這一特性的喪失,使脫離了實體腫瘤的惡性細(xì)胞逃脫了發(fā)生凋亡的命運而繼續(xù)存活

2、,并進一步發(fā)生遷徙、浸潤,形成轉(zhuǎn)移瘤和異位癌。這一過程與胚胎著床發(fā)育的過程極其相似,發(fā)生這一現(xiàn)象的腫瘤細(xì)胞在一定程度上具有了與干細(xì)胞類似的某些生物學(xué)特性。
  干細(xì)胞特異性基因Oct-4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族,在維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化過程起著關(guān)鍵性作用。胚胎形成過程中,一旦Oct-4基因表達異常,就會影響胚泡內(nèi)層細(xì)胞團發(fā)育,最終導(dǎo)致胚胎死亡。體外培養(yǎng)的細(xì)胞,通過單一因子Oct-4基因的誘導(dǎo)表達,已成功轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄苄?/p>

3、干細(xì)胞。同時,Oct-4基因在多種惡性腫瘤的起源中起著一定作用。將Oct-4基因?qū)?T3細(xì)胞后,可以使部分細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化,并且Oct-4基因可能通過激活和上調(diào)其下游靶基因的表達,導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。
  Survivin,凋亡抑制蛋白家族(IAP)的一員,能夠結(jié)合凋亡效應(yīng)蛋白caspases并調(diào)節(jié)其功能,從而阻斷凋亡過程。它在促進細(xì)胞增殖、抑制凋亡的平衡中起著重要的調(diào)控作用,也是生殖細(xì)胞產(chǎn)生與增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤過程中基質(zhì)黏附、新

4、血管生成、上調(diào)原癌基因表達的重要調(diào)節(jié)因素,已成為靶向腫瘤基因治療的重要目標(biāo)之一。
  現(xiàn)有實驗證實:敲除survivin基因可導(dǎo)致妊娠4~5天后的小鼠胚胎死亡。在降低小鼠胚胎細(xì)胞OCT-4表達時,Survivin基因啟動子的活性會顯著下降。而在腫瘤細(xì)胞株中Survinvin和Oct-4之間的是否存在同樣關(guān)系尚未有報道。本課題基于此,著重探討腫瘤細(xì)胞中Survinvin和Oct-4基因表達的調(diào)控機制。
  方法與結(jié)果
 

5、 本課題分為以下幾部分研究內(nèi)容:
  研究一:腺病毒重組質(zhì)粒pSurv-shRNA的構(gòu)建
  方法:在腺病毒載體的基礎(chǔ)上,引入Survivin基因啟動子,構(gòu)建的腺病毒shRNA載體,測序正確后,用293T細(xì)胞進行重組,TCID50法測定病毒滴度。
  結(jié)果:重組腺病毒質(zhì)粒pSurv-shRNA經(jīng)酶切、測序鑒定正確,重組病毒滴度達到后續(xù)試驗要求。
  研究二:肝膽腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達對Survivin抗

6、凋亡作用的調(diào)控研究
  方法:對臨床原發(fā)性肝癌、膽囊癌、膽管癌標(biāo)本Oct-4和Survivin的表達進行免疫組化鑒定;進一步建立肝癌、膽囊癌、膽管癌細(xì)胞系EHBH-H1、EH-GB1和EH-CA1,利用腺病毒攜帶Survivin-shRNA或Oct-4基因感染癌細(xì)胞系,利用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化,探討轉(zhuǎn)錄因子Oct-4與Survivin之間的相互調(diào)控及對癌細(xì)胞遺傳特性的影響。
  結(jié)果:臨床原發(fā)性肝癌、膽囊癌

7、、膽管癌標(biāo)本Oct-4陽性率達60.7%,Survivin陽性率達75.0%,且兩者之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系;特異性shRNA沉默EH-CA1癌細(xì)胞Survivin表達后,其Oct-4表達沒有變化,但誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生阻滯和細(xì)胞凋亡;EH-GB1癌細(xì)胞獲得Oct-4表達后,Survivin表達增強,促進了細(xì)胞周期運行并下調(diào)細(xì)胞凋亡。
  研究三:針對Oct-4和Survivin基因的雙靶向shRNA腺病毒載體的構(gòu)建及其對肝癌細(xì)胞的抑

8、制作用研究
  方法:根據(jù)GenBankNM001168的Survivin基因序列和DQ486513.1的OCT-4基因序列,設(shè)計相應(yīng)的shRNA。酶切回收目的片段,插入到含有腺病毒同源序列和綠色熒光蛋白(EGFP)基因表達盒序列的載體質(zhì)粒pAd-EGFP中,并構(gòu)建含雙靶向shRNA的載體pDual-shRNA。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞得到重組腺病毒,鑒定正確后,擴增、純化腺病毒,利用腺病毒攜帶特異性shRNA感染肝癌細(xì)胞系EHB

9、H-H1,通過Westernblotting、MTT和裸鼠荷瘤試驗檢測Oct-4和Survivin基因的表達情況及瘤體體積變化。
  結(jié)果:酶切、測序證實特異性shRNA腺病毒表達載體構(gòu)建成功。荷瘤試驗顯示有明顯的腫瘤生長抑制作用(P<0.01)。
  結(jié)論
  1、Oct-4可以增強腫瘤細(xì)胞Survivin的表達,從而發(fā)揮促進細(xì)胞周期運行、抑制細(xì)胞凋亡的作用;
  2、利用Oct-4調(diào)節(jié)Survivin啟動子的

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