腫瘤微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞調(diào)控及Treg細(xì)胞亞型與腫瘤相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　 生物治療是目前腫瘤治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域,不僅受到基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重視,更得到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)科學(xué)家及臨床醫(yī)生的關(guān)注。生物治療不僅是傳統(tǒng)治療手段的補(bǔ)充,更是治療觀念的更新,但其臨床應(yīng)用的安全性和有效性問題,仍是制約著腫瘤生物治療發(fā)展的兩大關(guān)鍵。
　　 現(xiàn)階段處于研究前沿的一種腫瘤生物治療方法是基于T細(xì)胞的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL)過繼免疫細(xì)胞治療(Adopti

2、ve CellTherapy／Adoptive Cell transfer Treatment,ACT)。同時(shí),腫瘤的一大生物學(xué)特征——免疫逃逸功能,也與腫瘤原位微環(huán)境中的抑制性免疫細(xì)胞密切相關(guān),如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor Associated Macrphage,TAM),耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenicDC)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T Lymphocyte,Treg)等。在TIL細(xì)胞中,這些抑制性免疫細(xì)胞

3、的存在,使基于T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞治療之效果和安全性受到懷疑。特別是Treg細(xì)胞,其能對提純培養(yǎng)的腫瘤殺傷性細(xì)胞產(chǎn)生干擾,并最終導(dǎo)致細(xì)胞治療的質(zhì)量的降低,這是學(xué)者們亟需破解的難題。
　　 Stat3基因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族(Signal transducers and activators oftranscription family,Stat)的成員,是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號(hào)通路JAK1／Stat3的調(diào)控因子。其在免

4、疫系統(tǒng)中同樣發(fā)揮著舉足輕重的作用,特別是對腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)免疫逃逸和免疫殺傷的平衡。與本研究密切相關(guān)的是,本研究前期發(fā)現(xiàn),在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中提取的TIL細(xì)胞含有Th17細(xì)胞。而IL-6-Stat3-Th17軸能促進(jìn)無菌性炎癥,這種“癌性炎癥”被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生過程密切相關(guān),此類能促進(jìn)腫瘤生長的Th17細(xì)胞與幫助腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中同時(shí)出現(xiàn),這兩者在腫瘤微環(huán)境中的相互作用值得深入探討。
　　 Treg細(xì)胞依

5、其來源可分為自然發(fā)生Treg(natural Treg,nTreg)和誘導(dǎo)發(fā)生Treg(induced Treg,iTreg)細(xì)胞,那么對于Treg細(xì)胞是否還可以通過其抑制功能再進(jìn)行亞型分類?腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的亞型分類是否與其抑制功能相符?本研究在離體條件下,對Treg的細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化嘗試,是立足于對現(xiàn)有細(xì)胞治療方法改進(jìn)的探索。為探討Stat3基因?qū)D4+T細(xì)胞的重要性,以及在進(jìn)行針對Stat3基因的靶向治療時(shí),Stat3基

6、因在腫瘤得中到抑制的同時(shí),微環(huán)境中正常CD4+T細(xì)胞抗腫瘤功能的會(huì)否受到影響?我們建立了CD4+T細(xì)胞特異性Stat3敲除的小鼠,對其介導(dǎo)的抗腫瘤免疫功能進(jìn)行評估。
　　 研究目的:
　　 明確Stag基因敲除對CD4+T細(xì)胞的發(fā)育和功能的影響,特別是其激活后增殖、分化能力的變化；研究Stat3-／-CD4+T細(xì)胞在介導(dǎo)過繼免疫治療時(shí)能否繼續(xù)發(fā)揮正常的支持作用；分析Stat3基因敲除導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞無法擴(kuò)增CD8+T細(xì)

7、胞的確切機(jī)制；通過建立模式動(dòng)物FoxP3gfp小鼠離體Treg細(xì)胞功能分析模型,了解Treg細(xì)胞的亞型再分的可能性；應(yīng)用小鼠水平的發(fā)現(xiàn),在人體腫瘤疾病模型中求證Treg的幼稚型亞型確實(shí)存在并占據(jù)重要地位；試驗(yàn)離體細(xì)胞因子誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化能力,為未來進(jìn)行過繼細(xì)胞免疫治療的改進(jìn)提供新思路。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.Stat3缺陷型CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠特異性抗黑色素瘤過繼細(xì)胞治療模型
　　 (1)CD4+T

8、細(xì)胞敲除Stat3基因的小鼠模型建立及表型分析
　　 通過Floxp-Cre重組酶系統(tǒng),我們建立了在CD4+T細(xì)胞中特異性敲除Stat3的16-21外顯子(包含SH2結(jié)構(gòu)域)的小鼠,從而分析Stat3蛋白功能失活對CD4+T細(xì)胞功能的影響。我們進(jìn)行了PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)及ELISA測定細(xì)胞因子釋放、FCM流式細(xì)胞術(shù)分析等一系列實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,Stat3的敲除并不影響CD4+T細(xì)胞的發(fā)育成熟,但其TCR激活增殖能力受

9、抑,且向Th17方向的分化能力完全缺失。
　　 (2)B16小鼠黑色素瘤移植瘤模型及過繼免疫治療療效分析
　　 當(dāng)我們以B16小鼠黑色素瘤接種Stat3-／-小鼠時(shí),其抗腫瘤免疫顯示出缺陷。進(jìn)一步的過繼免疫治療模型研究顯示,Stat3的敲除導(dǎo)致了CD4+T細(xì)胞在體內(nèi)雖然能夠被腫瘤細(xì)胞所激活,但其增殖減少而不能向CD8+殺傷性T細(xì)胞提供足夠的支持使其擴(kuò)增,最終導(dǎo)致過繼細(xì)胞治療的失效。
　　 (3)TCR受體下游信號(hào)

10、通路與Stat3信號(hào)通路對凋亡的調(diào)控分析
　　 對于Stat3敲除所導(dǎo)致的CD4+T細(xì)胞增殖下降的原因我們進(jìn)行了深入的探討。當(dāng)我們使用泛caspase抑制劑Z-VAD-fmk時(shí),TCR激活導(dǎo)致的Stat3-／-CD4+T細(xì)胞增殖受損得到了一定的恢復(fù),故而推測此種凋亡增加的現(xiàn)象與TCR受體通路和Bcl-2凋亡通路都有關(guān)。進(jìn)一步的Westernblot實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)明確了,TCR復(fù)合物通過ZAP70激酶蛋白調(diào)節(jié)Stat3磷酸化

11、激活,及下游Bcl-2家族的促凋亡蛋白上調(diào)、抑凋亡蛋白下調(diào)。
　　 2.乳腺癌腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的亞型比例及功能的研究
　　 (1)模式動(dòng)物FoxP3gfp小鼠的nTreg細(xì)胞亞型免疫抑制功能分析
　　 在我們使用FCM流式細(xì)胞術(shù)分析FoxP3gfp小鼠脾臟細(xì)胞來源的nTreg時(shí),發(fā)現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD62L和CD44可以將其進(jìn)一步分為幼稚型和記憶型亞系。經(jīng)MACS陰性分選、FACS陽性分選,證實(shí)這兩

12、種亞型細(xì)胞是獨(dú)立的兩群細(xì)胞,能夠被高純度的提純分離。而Treg細(xì)胞免疫抑制能力試驗(yàn)顯示,幼稚型Treg的抑制能力要強(qiáng)于記憶型。
　　 (2)FoxP3gfp小鼠的nTreg的各亞型誘導(dǎo)分化能力分析
　　 當(dāng)我們將幼稚型和記憶型Treg細(xì)胞亞系分選后,進(jìn)行離體細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化,發(fā)現(xiàn)幼稚型細(xì)胞具有更強(qiáng)的分化潛能。而在我們進(jìn)行三輪連續(xù)體外激活和細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化時(shí),幼稚型Treg細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的向Th17方向分化的能力,并且仍舊

13、保留FoxP3基因的表達(dá)。對于Th1和Th2方向的分化,幼稚型和記憶型Treg細(xì)胞都表現(xiàn)出不穩(wěn)定性,但是其都能夠向Th1方向大量轉(zhuǎn)化。
　　 (3)乳腺癌患者外周血及TIL中Treg細(xì)胞亞型分析
　　 以乳腺癌作為腫瘤疾病模型,我們使用FCM流式細(xì)胞術(shù)分析了乳腺癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中提取的TIL含Treg細(xì)胞的亞系比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不論使用CD45RA還是CD62L幼稚型細(xì)胞表面標(biāo)志來區(qū)分Treg,其幼稚型亞系的比例在

14、乳腺癌患者外周血中所占比例要高于健康人對照。在提取的TIL細(xì)胞中幼稚型Treg也占到比較大的比重。
　　 結(jié)論與創(chuàng)新:
　　 1.CD4+T細(xì)胞敲除Stat3基因后其在小鼠體內(nèi)的發(fā)育與分布不受影響。
　　 2.Stat3基因敲除導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞向Th17分化受抑,但Th1、Th2、Treg方向的分化不受影響；因而其分泌IL-17a能力下降,但其余多種細(xì)胞因子不受明顯影響。
　　 3.Stat3-／-CD

15、4+T細(xì)胞在離體TCR受體激活時(shí)增殖受抑、凋亡增加；且此種凋亡能夠被泛caspase抑制劑Z-VAD-fmk逆轉(zhuǎn)。
　　 4.此種Stat3基因敲除的CD4+T細(xì)胞不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫；并經(jīng)過繼免疫治療模型的反復(fù)驗(yàn)證,Stat3-／-CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫能力下降與其TCR激活后凋亡而不能擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞有關(guān)。
　　 5.進(jìn)一步的TCR信號(hào)通路和凋亡信號(hào)通路的分析表明,TCR受體激活通過ZAP70繼續(xù)激活S

16、tat3磷酸化,進(jìn)而調(diào)控Bcl-2家族的信號(hào)傳導(dǎo)通路受損是Stat3-／-CD4+T細(xì)胞不能發(fā)揮正?？鼓[瘤免疫功能的原因。
　　 6.模式動(dòng)物FoxP3gfp小鼠的nTreg細(xì)胞可以通過細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD62L／CD44進(jìn)一步分為幼稚型Treg(CD4+／FoxP3-GFP+／CD62L+／CD44-,na(i)ve Treg)和記憶型Treg細(xì)胞(CD4+／FoxP3-GFP+／CD62L-／CD44+,memory Tre

17、g)。
　　 7.經(jīng)MACS、FACS技術(shù)分選后,可以觀察到幼稚型和記憶型Treg確為兩群獨(dú)立的細(xì)胞,可以進(jìn)行高純度的分離。
　　 8.在體外免疫抑制功能檢測實(shí)驗(yàn)中,幼稚型Treg顯示出更強(qiáng)的抑制功能。
　　 9.在離體細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中,幼稚型Treg顯示出更強(qiáng)的向其他T輔助細(xì)胞系轉(zhuǎn)分化的能力。
　　 10.在乳腺癌患者外周血中,CD45RA+的幼稚型Treg和CD62L+的幼稚型Treg在總CD4