腸上皮γ-氨基丁酸能信號(hào)通路調(diào)節(jié)小腸液分泌及其作用機(jī)制.pdf

1、第一部分:γ-氨基丁酸能信號(hào)通路在腸上皮表達(dá)及對(duì)小腸液分泌的調(diào)節(jié)
　　目的:
　　γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，其在大腦和脊髓分布廣泛，參與突觸后神經(jīng)元的快速抑制效應(yīng)。在生理?xiàng)l件下，GABA由神經(jīng)元內(nèi)谷氨酸脫羧酶(GAD)催化谷氨酸形成。根據(jù)分子量的不同，GAD可分為兩種，分別為:GAD65(65kDa)和GAD67(67kDa)。GAD65主要分布

2、在神經(jīng)元軸突末梢內(nèi)的囊泡膜上，參與囊泡釋放的GABA的合成;GAD67則在神經(jīng)元胞體內(nèi)散在分布，其合成的GABA釋放后與突觸外的GABA受體結(jié)合發(fā)揮作用。神經(jīng)元軸突末梢的GABA釋放后快速激活突觸后膜上的GABAA（γ-氨基丁酸A型）受體門(mén)控的氯離子通道，引起氯離子向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，使突觸后神經(jīng)元細(xì)胞膜發(fā)生超極化，從而抑制神經(jīng)元的興奮性。GABA、GABA受體及其代謝酶等分子統(tǒng)稱為GABA信號(hào)系統(tǒng)(GABAergic signal syst

3、em)。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外，GABA能信號(hào)系統(tǒng)在外周組織也廣泛表達(dá)，如肺、肝臟、脾、生殖系統(tǒng)等。GABAA受體作為氯離子通道，在肺上皮細(xì)胞腔面?zhèn)缺磉_(dá)，并且被證實(shí)通過(guò)氯離子跨膜向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)氣管和支氣管電解質(zhì)和粘液的分泌。氯離子向腸腔內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道液體分泌的原動(dòng)力，腸道內(nèi)氯離子的聚集為水、鈉向腸道轉(zhuǎn)運(yùn)提供滲透壓和電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力基礎(chǔ)。有報(bào)道稱GABA能信號(hào)系統(tǒng)在胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)，但是其在正常消化道各部分的表達(dá)和生理作用尚不十

4、分清楚。我們推測(cè)GABA能信號(hào)系統(tǒng)可能在腸粘膜上皮表達(dá)，并且有可能參與腸道液體分泌。因此本研究的目的是觀察GABA能信號(hào)系統(tǒng)是否在小腸組織表達(dá)，尤其是在參與液體分泌的上皮細(xì)胞上的表達(dá)情況;探討GABA能信號(hào)系統(tǒng)在腸粘膜上皮表達(dá)的生理意義。
　　方法:
　　RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）
　　無(wú)菌條件下，將IEC-18（a cell line derived from the ileum of rat intesti

5、ne）細(xì)胞種植于直徑為10cm的圓形培養(yǎng)皿中;待細(xì)胞濃度增殖達(dá)到90％以上時(shí)，用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)沖洗細(xì)胞三次，加入Trizol試劑提取細(xì)胞RNA。
　　健康成年雄性Wistar大鼠脫頸犧牲后，小心取出大腦組織，用4℃預(yù)冷的PBS沖洗3次，剝離出新鮮大腦皮質(zhì)，剪碎后，加入Trizol提取組織RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明，提取細(xì)胞和組織的cDNA;然后用GABAA受

6、體各亞單位和GAD65/67的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)的DNA。再用DNA凝膠電泳觀察各目的帶表達(dá)情況。
　　免疫組織化學(xué)
　　石蠟切片染色步驟:將新鮮動(dòng)物組織用4％多聚甲醛(PFA)固定液浸泡24小時(shí)后，將組織脫水并用石蠟包埋后切片（組織厚度:4-5μm），依次進(jìn)行脫蠟、水化和抗原修復(fù)處理。用10％與二抗來(lái)源相同的血清室溫條件下封閉切片1小時(shí)后，加入一抗，4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，加入熒光標(biāo)記的

7、二抗室溫避光孵育1小時(shí)。PBS沖洗3次，每次5分鐘，75％甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察拍片。
　　細(xì)胞免疫染色步驟:將IEC-18細(xì)胞種植在10％多聚賴氨酸(PDL)包被的蓋玻片上，培養(yǎng)48小時(shí)，待細(xì)胞貼壁良好后，室溫條件下，用4％多聚甲醛迅速固定10分鐘，PBS沖洗三次，每次5分鐘，其余步驟同石蠟切片染色。
　　Western Blot
　　將新鮮組織或細(xì)胞勻漿后，4℃離心(12000g)10分鐘，取離心后的上清液

8、進(jìn)行蛋白定量。用10％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)下層膠和5％的上層分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45微米的PVDF(Polyvinylidene Fluoride)膜上，5％脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1小時(shí)，加入一抗覆蓋PVDF膜，4℃孵育過(guò)夜。用1倍的TTBS沖洗PVDF膜3次，每次10

9、分鐘。室溫下加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí)。用1倍TTBS沖洗3次，每次10分鐘，ECL顯影。
　　膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)
　　將IEC-18細(xì)胞種植在10％多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，24小時(shí)后待細(xì)胞貼壁，開(kāi)始全細(xì)胞記錄。記錄時(shí)用正常細(xì)胞外液(155mMNaCl、1.3mMCaCl2、5.4mMKCl、25mMHEPES和33mM葡萄糖(pH7.4，滲透壓315mosmol/kgH2O)）常溫循環(huán)灌流細(xì)胞，用700B放大器進(jìn)行

10、記錄。記錄電極內(nèi)液為155mM KCl、15mM KOH、10mMHEPES、2mM MgCl2、1mM CaCl2、10mMEGTA和2mM Tetraethylammonium(pH 7.35，滲透壓315 mosmol/kgH2O)。電壓鉗記錄時(shí)，將細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV。信號(hào)采集后用低通濾波器(1-2kH)進(jìn)行濾波處理。
　　在體小腸液分泌實(shí)驗(yàn)
　　成年雄性BALB/c小鼠，體重在25-30克之間，實(shí)驗(yàn)前禁食，自

11、由飲水。用2％戊巴比妥鈉（45-50mg/kg）腹腔注射麻醉動(dòng)物，固定四肢和頭部，在恒溫條件下(36℃-38℃)行開(kāi)腹手術(shù)。在距離盲腸1-2cm處結(jié)扎回腸，沿向心端方向量取2cm回腸進(jìn)行結(jié)扎，使之形成長(zhǎng)約2cm的回腸襻，用直徑為0.33mm的胰島注射器向腸襻內(nèi)注射100μl的生理鹽水或藥物，確保無(wú)滲漏后依次關(guān)閉腹腔各層。待動(dòng)物蘇醒后給予鼠糧和飲水。5小時(shí)后，脫頸犧牲小鼠，取出回腸襻，量取回腸襻的長(zhǎng)度和稱取去除腸液前后的腸襻重量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

12、分析。
　　統(tǒng)計(jì)分析
　　小腸液分泌試驗(yàn)中，用去除腸液前后重量差除以回腸襻的長(zhǎng)度(g/cm)作為觀察指標(biāo)，比較對(duì)照組和處理組之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05作為顯著性差異界值。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、RT-PCR結(jié)果顯示，小腸上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GABA的合成酶谷氨酸脫羧酶65和67(GAD65/67)以及GABAA受體各亞

13、單位;并且，在大鼠、小鼠的小腸以及小腸上皮細(xì)胞株等組織細(xì)胞表達(dá)GABAA受體β2、π亞單位以及GAD65/67蛋白。
　　2、免疫熒光染色結(jié)果顯示GABA和GAD65/67在小腸上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)，GABAA受體β2/β3和π單位分別在IEC-18細(xì)胞膜和小鼠、胎豬的小腸絨毛上皮細(xì)胞腔面?zhèn)缺磉_(dá)。
　　3、人的回腸隱窩和絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)也表達(dá)谷氨酸脫羧酶65/67和GABAA受體π亞單位。
　　4、膜片鉗全細(xì)胞記錄顯示，小

14、腸上皮IEC-18細(xì)胞，其膜電位在-37±8mV;在約36％的細(xì)胞上記錄到GABA誘導(dǎo)的內(nèi)向電流，GABAA受體特異性激動(dòng)劑—muscimol可模擬上述反應(yīng)。電流鉗記錄結(jié)果顯示muscimol導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜去極化。
　　5、小鼠回腸襻液體分泌實(shí)驗(yàn)表明，GABA(100μM)和muscimol(10μM)均促進(jìn)小腸液體的分泌，這種促分泌作用不能被TTX（1μM，河豚毒素）阻斷;而GABAA受體特異性阻斷劑—Gabazine(100μ

15、M)則明顯降低GABA引起的小腸液分泌量。
　　結(jié)論:
　　1，GABA能信號(hào)系統(tǒng)在小鼠、大鼠、豬和人的小腸上皮細(xì)胞功能性表達(dá)
　　2，GABA可通過(guò)GABAA受體參與小腸液體分泌。
　　第二部分:γ-氨基丁酸能信號(hào)通路在腹瀉發(fā)生中的作用及其機(jī)制
　　目的:
　　腹瀉是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)癥狀，病因和發(fā)病機(jī)制多樣，但大多數(shù)是由于病毒或細(xì)菌毒素侵犯腸道黏膜，破環(huán)腸道結(jié)構(gòu)和腸道上皮細(xì)胞正常的分泌和吸收，導(dǎo)

16、致腸道組織通透性增加和上皮細(xì)胞電解質(zhì)和粘液分泌增多，引起腹瀉。由于小腸上皮細(xì)胞腔面膜上的氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是腸道水、鈉、鉀、碳酸氫根等物質(zhì)分泌的原動(dòng)力，很多腹瀉的發(fā)生機(jī)制都離不開(kāi)腸道上皮細(xì)胞膜上氯離子通道的參與，如CFTR和CaCC兩種氯離子通道與霍亂毒素和旅行者腹瀉的發(fā)生有直接關(guān)系。因此，對(duì)腸上皮細(xì)胞上氯離子通道的研究以及開(kāi)發(fā)通道特異性的藥物為臨床治療腹瀉提供重要的理論基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)GABA能信號(hào)系統(tǒng)在小腸上皮細(xì)胞表達(dá)，外源性GABAA受

17、體激動(dòng)劑引起小腸液的大量分泌。因此我們推測(cè)，GABAA受體作為氯離子通道受體，有可能參與腹瀉的發(fā)生過(guò)程。本部分我們對(duì)GABA能信號(hào)系統(tǒng)在食物過(guò)敏原誘導(dǎo)的腹瀉過(guò)程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)探討。
　　方法:
　　免疫組織化學(xué)同第一部分
　　食物致敏原誘導(dǎo)的腹瀉動(dòng)物模型的建立
　　健康成年雄性BALB/c小鼠(20-25g)，隨機(jī)分為對(duì)照組、OVA(50mg，Ovalbumin，卵白蛋白)誘導(dǎo)模型組、OVA誘導(dǎo)和Ga

18、bazine(100μM)處理組、OVA誘導(dǎo)和Picrotoxin(100μM)處理組（非特異性GABAA受體阻斷劑）。實(shí)驗(yàn)前禁食，自由飲水。所有動(dòng)物在處理第一天均用硫酸鋁佐劑稀釋的OVA(1mg)腹腔內(nèi)注射，致敏全部小鼠。從第七天開(kāi)始，對(duì)照組給予生理鹽水250μl灌胃，模型組和處理組給予OVA和相應(yīng)藥物溶于生理鹽水中250μl灌胃，1小時(shí)后觀察并記錄動(dòng)物糞便性狀和排便反應(yīng)。隔天灌胃一次，共灌胃10次后犧牲動(dòng)物，收集動(dòng)物回腸進(jìn)行免疫組織

19、化學(xué)染色和Westernblot檢測(cè)。
　　Western Blot
　　動(dòng)物組織蛋白獲取和檢測(cè)步驟同第一部分。
　　IL-13處理后的IEC-18細(xì)胞，預(yù)冷的PBS沖洗3次，用裂解液破碎和收集細(xì)胞，4℃離心，取離心上清液蛋白定量，加入上樣緩沖液后變性蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí)，TTBS沖洗3次，每次10分鐘，加入一抗，4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。TTBS沖洗3次

20、，每次10分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫條件下孵育1小時(shí)，TTBS洗3次后，ECL顯影。
　　統(tǒng)計(jì)分析
　　動(dòng)物模型指標(biāo)觀察:灌胃后1小時(shí)觀察動(dòng)物糞便稀薄、透明、不成型視為腹瀉模型成功，計(jì)數(shù)每次灌胃后模型成功動(dòng)物的個(gè)數(shù)，依次累計(jì)，直至犧牲動(dòng)物。以每次灌胃后各組動(dòng)物腹瀉發(fā)生率作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)作圖分析。
　　結(jié)果:
　　1，OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性動(dòng)物腹瀉模型在第7次灌胃時(shí)達(dá)到100％成功;對(duì)照組動(dòng)物無(wú)動(dòng)物發(fā)生腹瀉;

21、用Gabazine和Picrotoxin處理的兩組動(dòng)物，明顯降低小鼠腹瀉的發(fā)生率并延緩腹瀉的進(jìn)程。
　　2，OVA誘導(dǎo)的腹瀉動(dòng)物回腸表達(dá)GAD67和GABAA受體β2/β3、π亞單位比對(duì)照組顯著增高。GABAA受體阻斷劑則降低動(dòng)物腸道β2/β3蛋白的表達(dá)，而小腸上皮細(xì)胞和腔面膜上的谷氨酸脫羧酶65/67、π亞單位表達(dá)則增加。
　　3，IL-13作用4分鐘和4.5分鐘時(shí)最高。而GABAA受體β2/β3亞單位蛋白表達(dá)量亦在IL-