MiR-15b-5p在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，現(xiàn)已成為成人最主要的致盲因素，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前，隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，DR的患病人數(shù)也在逐年增多。DR的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚不十分明確。關(guān)于DR的發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō)，如蛋白激酶C-甘油二酯、多元醇通路激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物增多、氧化應(yīng)激等均與DR的發(fā)病密切相關(guān)。已有研究證實(shí)

2、，microRNAs在DR的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。microRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，主要通過(guò)抑制信使RNA(mRNA)的轉(zhuǎn)錄后翻譯來(lái)調(diào)控蛋白表達(dá)。由于microRNAs在DR發(fā)病過(guò)程中的機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的microRNAs進(jìn)行表達(dá)譜分析，挑選出顯著差異性表達(dá)microRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選可能與DR發(fā)生有關(guān)的microRNAs，用在線軟件預(yù)測(cè)系統(tǒng)預(yù)測(cè)其靶分子，最終在基因水

3、平上進(jìn)一步揭示在DR發(fā)生的機(jī)制，為DR的預(yù)防和治療提供全新的依據(jù)和思路。
　　方法：
　　1、制備糖尿病大鼠模型：選取體重介于200-220g之間的雄性SD大鼠30只，將其隨機(jī)分為兩組，其中對(duì)照組10只，糖尿病組20只。腹腔單次注射檸檬酸緩沖液60 mg/kg作為對(duì)照組，腹腔單次注射1％STZ60 mg/kg，作為實(shí)驗(yàn)組。72小時(shí)之后，檢測(cè)SD大鼠尾部末端靜脈血漿葡萄糖水平，若血糖值大于16.7mmol/L提示造模成功。

4、r>　　2、制備糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變模型：造模成功后，在糖尿病SD大鼠8周、12周、16周時(shí)摘取眼球。其中一只眼球摘取后迅速剝離視網(wǎng)膜組織凍于液氮中保存用于microRNAs的檢測(cè)，另一只眼球摘取后置于4%的多聚甲醛中固定，固定48小時(shí)后的眼球組織一部分制備成蠟塊進(jìn)行 HE染色測(cè)量視網(wǎng)膜厚度并對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Ganglion cell，GCL）的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，固定好的另一部分的眼球組織在解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜組織，放于37℃3%的胰

5、蛋白酶中消化2小時(shí)，待其消化至一層透明的血管網(wǎng)時(shí)，將其撈至潔凈的防脫載玻片上并進(jìn)行過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)（糖原染色、PAS）染色，觀察視網(wǎng)膜血管的大致形態(tài)及典型改變進(jìn)行分析。
　　3、根據(jù)前期用HUVECs制備的氧化應(yīng)激模型的microRNAs基因表達(dá)譜改變情況，結(jié)合分析人與大鼠種屬差異性的情況，篩選可能與我們的研究相關(guān)的 microRNAs。
　　4、用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)方法檢測(cè) microRNA

6、s在 SD大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)，并通過(guò)全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)（ Kyoto Encyclopedia of Genes,KEGG）分析異常表達(dá)microRNAs可能參與的信號(hào)通路。應(yīng)用DAVID軟件對(duì)異常表達(dá)的microRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并對(duì)可能參與的信號(hào)通路進(jìn)行生物功能富集分析（Enrichment for Gene Ontology， GO）。
　　5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)采用(x±s)表示。用IBM SPSS21.0軟

7、件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用方差分析和獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、對(duì)照組10只SD大鼠的靜脈血糖水平均在正常范圍；實(shí)驗(yàn)組20只SD大鼠中一只死亡，剩余19只均造模成功，即靜脈血糖水平大于16.7mmol/L。
　　2、摘取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠眼球后進(jìn)行HE染色，測(cè)量視網(wǎng)膜層特定部位厚度后統(tǒng)計(jì)得出，實(shí)驗(yàn)組大鼠的視網(wǎng)膜厚度與正常對(duì)照組大鼠相比下降，GCL數(shù)量減少。PAS染色

8、提示16周時(shí)實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)典型改變。其中造模成功后16周的實(shí)驗(yàn)組大鼠變化最明顯，故在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中提取造模成功后16周的實(shí)驗(yàn)組大鼠的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行microRNAs檢測(cè)。
　　3、microRNAs芯片結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組有5個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNAs(P<0.05)，綜合分析microRNAs芯片結(jié)果，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ Real-time PCR）的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-15b-5

9、p，miR-17-5p，miR-195-5p，miR-497-5p，miR-106b-5p的表達(dá)，其中miR-15b-5p在大鼠視網(wǎng)膜組織中的相對(duì)表達(dá)量變化最為明顯。
　　4、miR-15b-5p的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：miR-15b-5p參與了鈣離子信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、胰島素信號(hào)通路、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、2型糖尿病、粘附作用、前列腺癌等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。miR-15b-5p的靶基因主要參與了2型糖尿病、胰島素信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡等多種生物