GDF5-L373R突變導(dǎo)致指(趾)骨間關(guān)節(jié)粘連的作用機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、生長(zhǎng)分化因子5(Growth differentiation factor5,GDF5)又稱軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1)或骨形態(tài)發(fā)生蛋白14(bonemorphogenetic protein14,BMP14),是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growthfactor-beta,TGF-β)超家族中的一員。GDF5作為機(jī)體軟骨形成、骨

2、骼發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子之一,近年來受到了廣泛的研究與關(guān)注。人GDF5基因定位于20q11.2,全長(zhǎng)488 kb,編碼501個(gè)氨基酸,由位于N端的信號(hào)肽、中間的前體肽以及C端的成熟肽三個(gè)部分構(gòu)成。GDF5第377-381位氨基酸殘基(RRKRR)為前蛋白轉(zhuǎn)化酶作用位點(diǎn),前體單肽鏈合成后將通過二硫鍵形成同源二聚體或與其他BMP家族成員形成異源二聚體,而后N端前體蛋白被切除并釋放出C端成熟蛋白,并分泌到細(xì)胞外后發(fā)揮其生物學(xué)作用。
  

3、GDF5是軟骨和骨骼形成的重要調(diào)節(jié)因子,主要表達(dá)于胚胎早期的軟骨聚集區(qū)、軟骨膜以及關(guān)節(jié)區(qū)間域。在骨骼發(fā)育初期,GDF5可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞在一定部位的聚集與粘附,而后期則能夠刺激軟骨細(xì)胞的增生與肥大。GDF5基因突變可以引起多種類型的骨骼發(fā)育不良疾病,近端指(趾)骨間關(guān)節(jié)粘連(Proximal symphalangism,SYM1)就是其中一種。SYM1是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,主要由GDF5或其抑制基因NOG突變引起,以肢端骨骼融合

4、和短指(趾)為主要表型,病變多發(fā)生于近節(jié)指骨和中指骨處,表現(xiàn)為近節(jié)指骨變長(zhǎng)、中指骨變短、關(guān)節(jié)腔狹窄,使近節(jié)指骨關(guān)節(jié)不能曲伸或曲伸受限,常累及第3、4和5指,還可伴有耳聾、視力發(fā)育異常等其他癥狀。
   本課題組在前期收集的一個(gè)中國漢族SYM1的家系中確定其致病原因?yàn)镚DF5c.1118T>G(p.L373R)突變,迄今為止文獻(xiàn)報(bào)道的能夠引起SYM1的GDF5突變共有五種:R438L、E491K、N445K/T和L373R,其中E

5、491K、L373R為中國家系突變,L373R為本課題組首次報(bào)道的突變。該突變位于GDF5前體蛋白轉(zhuǎn)化酶作用位點(diǎn)附近,在不同種屬之間具有很高的保守性。為了明確GDF5-L373R突變的致病方式和途徑,我們構(gòu)建了多種表達(dá)載體,研究了野生型和突變型GDF5前體蛋白水解效率、成熟蛋白分泌表達(dá)量以及軟骨/骨發(fā)育信號(hào)通路中相關(guān)信號(hào)分子的改變,以探討揭示GDF5-L373R致病新突變導(dǎo)致SYM1的可能作用機(jī)制。
   材料方法
  

6、 一、GDF5-L373R突變對(duì)GDF5蛋白表達(dá)的影響
   敲除信號(hào)肽的野生型和突變型GDF5真核表達(dá)載體(peDNA3.1-GDF5-WTdelsp和peDNA3.1-GDF5-L373Rdelsp)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。48小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測(cè)GDF5前體蛋白和GDF5成熟蛋白表達(dá)量的變化,并計(jì)算成熟蛋白占前體蛋白的百分比數(shù)。
   二、GD F5-L373R突變對(duì)GDF5蛋白與其受體結(jié)

7、合能力的影響
   野生型和突變型GDF5真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-GDF5-WT和pcDNA3.1-GDF5-L373R)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。48小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白,采用免疫沉淀技術(shù)將細(xì)胞裂解液與GDF5抗體共孵育,通過Western Blot檢測(cè)GDF5蛋白與受體BMPRIB結(jié)合能力的變化。
   三、GDF5-L373R突變對(duì)與軟骨/骨發(fā)育相關(guān)通路因子的影響
   野生型和突變型GDF5慢病毒表

8、達(dá)載體(LV-GDF5-WT和LV-GDF5-L373R)感染ATDC-5細(xì)胞。感染3-4天后,采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)分別在RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)GDF5、ALP、ColⅡ、p-Smad1/5/8、Smurf1以及ID1的變化。
   四、TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCR Array基因芯片檢測(cè)GDF5-L373R突變后相關(guān)基因的差異表達(dá)
  

9、 野生型和突變型GDF5真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ATDC-5細(xì)胞。48小時(shí)后以Trizol收集細(xì)胞,由上??党缮锕具M(jìn)行TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCRArray芯片檢測(cè)。
   五、GDF5-L373R突變蛋白亞細(xì)胞定位的研究
   分別以pDsRed1-N1-GDF5-WT、pDsRed1-N1-GDF5-L373R載體和pDsRed1-N1空載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)

10、胞。轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后,熒光顯微鏡下觀察比較各實(shí)驗(yàn)組間熒光分布情況。
   實(shí)驗(yàn)結(jié)果
   一、GDF5-L373R突變導(dǎo)致GDF5成熟蛋白表達(dá)降低vWestern Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與野生型相比GDF5-L373R突變后導(dǎo)致GDF5前體蛋白和成熟蛋白表達(dá)均明顯降低,但是其成熟蛋白占前體蛋白的百分?jǐn)?shù)比值卻升高,推測(cè)突變可能導(dǎo)致GDF5前體蛋白有效的水解作用上調(diào)。
   二、G DF5-L373R突變導(dǎo)致G

11、DF5蛋白與其受體結(jié)合能力下調(diào)
   采用免疫沉淀技術(shù),通過Western Blot檢測(cè)GDF5與受體BMPRIB的結(jié)合能力,結(jié)果顯示GDF5-L373R突變導(dǎo)致GDF5蛋白與BMPRIB結(jié)合能力下調(diào)。
   三、GDF5-L373R突變對(duì)與軟骨/骨發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路因子的影響
   在RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)了相關(guān)骨/軟骨發(fā)育信號(hào)通路中因子的變化,結(jié)果顯示GDF5-L373R突變后在RNA水平上檢測(cè)到Gdf5表達(dá)

12、下調(diào)、Alp表達(dá)上調(diào);在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)到p-Smad1/5/8和ID1表達(dá)下調(diào);Smurf1和ColⅡ表達(dá)上調(diào)。
   四、TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCR Array基因芯片檢測(cè)GDF5-L373R突變后相關(guān)基因的差異表達(dá)
   基因芯片共檢測(cè)了TGF-β/BMP信號(hào)通路中84個(gè)相關(guān)通路因子,我們重點(diǎn)關(guān)注了前期檢測(cè)的Smad信號(hào)通路中的相關(guān)因子,經(jīng)驗(yàn)證基本與我們前

13、期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。此外,我們還觀察到了p21的差異表達(dá),通過Western Blot在蛋白水平上檢測(cè)到突變后p21表達(dá)下調(diào),提示GDF5-373R突變后可能會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生影響。
   五、GDF5-L373R突變蛋白亞細(xì)胞定位的研究
   經(jīng)熒光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果顯示野生型和突變型GDF5蛋白質(zhì)均定位于細(xì)胞漿,沒有檢測(cè)到其在細(xì)胞核的定位。
   結(jié)論:
   GDF5-L373R突變由于減弱了與B

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