卡巴膽堿干預大鼠腹腔粘連的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究膽堿能受體激動劑卡巴膽堿對大鼠腹腔粘連形成的干預作用；
　　 2.研究卡巴膽堿對粘連組織微血管生成和微血管內皮細胞VEGF表達的影響及其與膽堿能抗炎通路的關系。
　　 方法：分動物實驗和細胞實驗兩部分
　　 1.動物實驗:采用健康雄性60-70日齡Wistar大鼠，體重(200～220)g，完全隨機法分為8組：①假手術組(S組，n=8)，開腹后不做任何處理；②腹腔粘連組(A組，n=1

2、4)，行腹腔粘連手術；③卡巴膽堿處理組(C組，n=14)，腹腔粘連術后腹腔注射卡巴膽堿(60μg/kg.ml)；④煙堿處理組(N組，n=14)，腹腔粘連術后腹腔注射煙堿(1mg/kg.ml)；⑤生理鹽水組(NS組，n=8)，腹腔粘連術后腹腔注射生理鹽水(1ml/kg)；⑥α-銀環(huán)蛇毒素組(α組，n=12)，腹腔粘連術后腹腔注射α-銀環(huán)蛇毒素(1μg/kg.ml)；⑦卡巴膽堿+α-銀環(huán)蛇毒素組(C/α組，n=12)，腹腔粘連術后腹腔注射α

3、-銀環(huán)蛇毒素(1μg/kg.ml)，15分鐘后腹腔注射卡巴膽堿(60μg/kg.ml)；⑧煙堿+α-銀環(huán)蛇毒素組(N/α組，n=12)，腹腔粘連術后腹腔注射α-銀環(huán)蛇毒素(1μg/kg.ml)，15分鐘后腹腔注射煙堿(1mg/kg.ml)。采用無菌干紗布摩擦大鼠盲腸蚓突末端復合左側腹壁縫合固定硅膠膜法制作大鼠腹腔粘連動物模型，于術畢即刻、術后24小時、48小時腹腔局部注射藥物，術后第10天處死大鼠。用Chiang分類法評估大鼠大體腹腔粘

4、連程度。取粘連組織切片行HE染色觀察粘連組織病理變化及微血管增生情況，免疫組織化學法檢測粘連組織VEGF表達，并進行圖像分析。
　　 2.細胞實驗:采用組織塊法培養(yǎng)Wistar大鼠肺微血管內皮細胞。實驗分為7組：①TNF-α組(T組)：TNF-α終濃度為10ng/ml；②卡巴膽堿+TNF-α組(C組，分5個亞組，卡巴膽堿終濃度分別為2mmol/1(C1組)、0.2mmol/1(C2組)、0.02mmol/1(C3組)、2μmol

5、/1(C4組)、0.2μmol/1(C5組)，TNF-α終濃度為10ng/ml)；③煙堿+TNF-α組，(N組，煙堿終濃度為0.2mmol/1，TNF-α終濃度為10nglml)；④α-銀環(huán)蛇毒素+TNF-α組，(α組，α-銀環(huán)蛇毒素終濃度為6μg/ml，TNF-α終濃度為10ng/ml)；⑤α-銀環(huán)蛇毒素+卡巴膽堿(C2)+TNF-α組，(C2/α組，α-銀環(huán)蛇毒素終濃度為6μg/ml，卡巴膽堿終濃度為0.2mmol/1，TNF-α終

6、濃度為10ng/ml)；⑥α-銀環(huán)蛇毒素+煙堿組+TNF-α，(N/α組，α-銀環(huán)蛇毒素終濃度為6μg/ml，煙堿終濃度為0.2mmol/1，TNF-α終濃度為10ng/ml)；⑦單純細胞組(B組)，只加細胞和培養(yǎng)液，不加其它試劑。通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、CD31和VIII因子免疫細胞化學染色進行細胞鑒定。MTT法檢測大鼠肺微血管內皮細胞增殖情況。ELISA法檢測肺微血管內皮細胞VEGF的生成。
　　 結果：
　　

7、 1.假手術組大鼠未出現腹腔粘連，腹腔粘連組14只大鼠均出現了腹腔粘連，粘連評分區(qū)間為6-12分，說明摩擦大鼠盲腸蚓突末端復合左側腹壁縫合固定硅膠膜法可成功制作大鼠腹腔粘連動物模型。
　　 2.倒置相差顯微鏡下觀察見培養(yǎng)細胞呈梭形，鋪路石樣排列，單層貼壁生長，CD31和VIII因子免疫細胞化學染色呈陽性反應，說明培養(yǎng)細胞為肺微血管內皮細胞。
　　 3.與腹腔粘連組比較，經卡巴膽堿和煙堿處理后，大鼠腹腔粘程度明顯減輕，粘

8、連組織微血管生成及VEGF表達減少；用α-銀環(huán)蛇毒素阻斷α7nAchR后，卡巴膽堿、煙堿抑制腹腔粘連的作用明顯減輕。
　　 4.卡巴膽堿、煙堿能抑制TNF-α刺激后大鼠肺微血管內皮細胞增殖及VEGF生成，阻斷微血管內皮細胞α7nAchR能顯著減輕擬膽堿藥的作用。
　　 結論：卡巴膽堿能明顯減輕大鼠腹腔粘連程度；其機制可能與其興奮α7nAChR，下調粘連組織中促炎因子水平、抑制粘連組織微血管生成和微血管內皮細胞VEGF表達