抗精子適體的制備及其在精子富集上的研究.pdf

1、探索精子細胞的高敏感高特異性新檢測方法對于實現(xiàn)法醫(yī)學(xué)中精斑的確認與個體識別具有極其重要的意義。傳統(tǒng)的精斑、精子檢測方法主要有通過鏡檢觀察精子的細胞形態(tài)，抗原抗體反應(yīng)或者檢測精斑中特殊含量的酶等。確定精斑后，可通過差異裂解等方法分離出精子DNA，再進行精子DNA擴增與后續(xù)DNA分型。這些方法往往因為雜質(zhì)（包括女性陰道上皮細胞 DNA）的干撓而存在敏感性低，甚至假陽性等局限性。
　　核酸適體（aptamer）因其親和力高、特異性強、合

2、成經(jīng)濟、易保存，可通過熒光基團等修飾使其與靶標(biāo)的結(jié)合成為可視性等優(yōu)點，被用作為一類新型分子探針，即可用來作為識別探針，也可用來構(gòu)建捕捉工具，廣泛地應(yīng)用于細胞的檢測和富集中。本課題體外合成長度為84個堿基（包含已知序列的上、下游引物各22個堿基）的隨機單鏈作為初級文庫，通過全細胞改良指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化（cell-SELEX）技術(shù)篩選出7條與精子細胞特異性結(jié)合的單鏈DNA適體，利用Clustal2.05、mfold軟件對DNA適體序列進

3、行一級結(jié)構(gòu)同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，然后采用熒光標(biāo)記法檢測單鏈 DNA適體與精子細胞的特異性結(jié)合，挑選出與精子細胞特異性結(jié)合的A-3適體進行精子細胞富集實驗。
　　精子細胞富集實驗中將生物素修飾的A-3適體固定在鏈霉素磁珠上，通過生物素-鏈霉親和素的作用，制備了能特異性捕獲、富集精子細胞的A-3適體功能化磁珠。該A-3適體功能化磁珠捕獲精子細胞后，在簡單的磁場力下即可對精子細胞進行富集。在精子細胞數(shù)量超過10000時，捕獲效率穩(wěn)定

4、在60％以上，A-3適體功能化磁珠對精子細胞的最低檢測線為100個數(shù)量級。當(dāng)細胞混合液中10000/mL的精子細胞和10000/mL上皮細胞時，A-3適體功能化磁珠可以將其中64.26%的精子細胞分離出來，分離純度超過了96%。
　　我們采用特異性A-3適體結(jié)合磁珠建立了精子分離技術(shù)，并進一步建立以富集為特征的精子細胞檢測新方法。該方法既可以用來在光學(xué)顯微鏡下直接檢驗精子細胞，也可以用來提高其他檢測手段（例如下游的PCR法）的敏感

5、性。本課題通過法醫(yī)學(xué)上的實際應(yīng)用，進一步驗證了磁珠富集分離法的實用性。由性犯罪現(xiàn)場取證回來的9份精斑痕跡標(biāo)本，按常規(guī)方法制備提取液。A-3適體功能化磁珠因生物素標(biāo)記的A-3適體能特異捕獲精斑提取液中的精子，在簡單的磁場力作用下便能通過生物素-連霉親和素作用力實現(xiàn)精子細胞的富集。將富集得到的精子細胞進行STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）基因座的單一男性分型。傳統(tǒng)的差異裂解法作為對照。初步實驗結(jié)果表明，差異裂解法成功得到三份精斑STR基因座的單一男性

6、分型，磁珠分離法得到兩份。其中有一份標(biāo)本同時成功地被差異裂解法和磁珠分離法陽性檢出，檢測結(jié)果彼此一致；另有一份標(biāo)本未能被差異裂解法檢出，但用磁珠分離法成功地檢出分型，其結(jié)果與嫌疑犯的血液標(biāo)本檢測結(jié)果一致。
　　本研究通過改良的cell-SELEX方法篩選了7條抗人精子aptamer，通過熒光顯微鏡對混合細胞的檢測證實了aptamer結(jié)合精子的特異性。其中A-3 aptamer用來進一步研究，建立了基于 aptamer的精子分離法，