CFTR參與人類精子受精及其表達(dá)與精子質(zhì)量相關(guān).pdf

1、我們以前報(bào)道了囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic FibrosisTransmembrane Conductance Regtnator,CFTR)是環(huán)磷酸腺苷(cAMP)激活的氯離子(Cl-)通道,參與調(diào)節(jié)小鼠和豚鼠精子獲能及受精過程。已有研究報(bào)道CFTR基因突變可以導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。然而CFTR對(duì)人精子受精能力的影響,及其表達(dá)率與精子質(zhì)量間的關(guān)系仍未確定。本次研究擬闡明一些因?yàn)椴幻餍阅行圆挥Y,并可為男性不育癥診斷提供新方法及

2、開發(fā)男性避孕藥提供新思路。
　　 目的:
　　 探討CFTR對(duì)人類精子受精能力的影響及其表達(dá)率與精子質(zhì)量間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.為了闡明CFTR對(duì)人類精子受精能力的影響,我們采用以下方法進(jìn)行了深入研究:
　　 1)在培養(yǎng)基內(nèi)加入不同試劑(孕酮及CFTRinh-172)后進(jìn)行精子獲能培養(yǎng)5h,隨后采用金霉素(Chlorotetracycline,CTC)熒光染色法,檢測各組獲能精子百分率

3、(“B+AR”％),分析各組之間“B+AR”％是否存在顯著差異性,從而評(píng)價(jià)CFTRinh-172對(duì)精子獲能的影響。
　　 2)精子獲能培養(yǎng)5h后,通過用環(huán)磷酸腺苷酶免疫法(EnzymeImmunoassay,EIA)來測定獲能前后及不同組精子細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,分析不同時(shí)間及不同組別之間cAMP濃度的差異性,進(jìn)而評(píng)價(jià)CFTRinh-172對(duì)精子細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響,從另一角度來研究CFTR與人類精子獲能間的關(guān)系。
　　

4、 3)對(duì)于精子頂體反應(yīng)評(píng)價(jià),我們同樣在培養(yǎng)基內(nèi)加入不同試劑(rhZP3a及CFTRinh-172)后進(jìn)行精子獲能培養(yǎng),采用CTC熒光染色法來檢測各組精子頂體反應(yīng)率(“AR”％),統(tǒng)計(jì)分析各組之間“AR”％是否存在顯著差異性,從而分析CFTRinh-172對(duì)精子頂體反應(yīng)的影響。
　　 4)將人精子與去透明帶倉鼠卵子在不同試劑內(nèi)(孕酮及CFTRinh-172)共同培養(yǎng)3h后,應(yīng)用去透明帶倉鼠卵精子穿透實(shí)驗(yàn)(SpermPenetra

5、tion Assay,SPA)檢測各組精子穿透率(精子穿透的卵子數(shù)/卵子總數(shù)×100％)及穿透指數(shù)(穿透卵子的精子總數(shù)/卵子總數(shù)×100％),比較各組之間是否存在差異,從而研究CFTRinh-172對(duì)精子受精能力的影響,尤其是對(duì)人精子體外精卵融合過程的影響。
　　 2.為了探討CFTR在人類精子上的表達(dá)率與精子質(zhì)量間的關(guān)系,我們將精液標(biāo)本直接用PBS液洗三次之后,采用間接免疫熒光染色法檢測CFTR在生育男性、健康男性及不育男性(

6、主要包括畸形精子癥、弱畸形精子癥、弱精癥及少精癥)精子上的表達(dá)率,觀察不同類型精子上CFTR表達(dá)率是否有顯著差異性,進(jìn)而探討CFTR在人類精子上的表達(dá)率是否與精子質(zhì)量相關(guān)。
　　 結(jié)果：
　　 1.精子獲能培養(yǎng)后,P4組“B+AR”％明顯高于對(duì)照組(P<0.01),表明P4促進(jìn)精子獲能；而CFTRinh-172各濃度組的“B+AR”％顯著低于P4組(P<0.01),表明CFTRinh-172顯著地抑制P4對(duì)精子獲能的促進(jìn)

7、作用,且在10nM-1μM范圍內(nèi)呈濃度依賴性。
　　 2.獲能培養(yǎng)5h后精子細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度明顯比培養(yǎng)前要高(P<0.01),表明獲能促進(jìn)精子細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生；而在100nM CFTRinh-172存在下,獲能培養(yǎng)5h后精子內(nèi)cAMP濃度明顯低于5h對(duì)照組(P<0.01),說明CFTRinh-172降低獲能精子細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。
　　 3.精子獲能培養(yǎng)后,rhuZP3a組“AR”％顯著高于對(duì)照組(P<0.01),表

8、明rhuZP3a,誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)；而CFTRinh-172各濃度組的“AR”％顯著低于rhuZP3a.組(P<0.01),表明CFTRinh-172顯著地抑制rhuZP3a對(duì)精子頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)作用,且在10hM-1μM范圍內(nèi)呈濃度依賴性。
　　 4.以卵內(nèi)膨大的精子頭和其相連的尾部存在,作為精子穿透指標(biāo)。穿透率及穿透指數(shù)作為評(píng)價(jià)精子受精能力指標(biāo)。與對(duì)照組及P4組相比,CFTRinh-172100nM組穿透率及穿透指數(shù)均明顯

9、下降(P<0.01),表明CFTRinh-172不僅抑制精子獲能及頂體反應(yīng),還特異性的抑制精卵融合過程。
　　 5.間接免疫熒光染色法檢測顯示CFTR定位在人精子頭部赤道板上,其在不同類型人精子上的表達(dá)存在顯著差異:生育男性組CFTR表達(dá)率(87.9±3.9％)顯著高于健康男性組(56.5±20.8％)及不育男性組(47.0±22.8～18.7±10.8％)(P<0.01)。表明CFTR在人類精子上的表達(dá)率與精子質(zhì)量相關(guān)。