抗精子適體的制備及其抑精功能的初步研究.pdf

1、目前我國(guó)市面上所售避孕用品雖然能有效降低非意愿妊娠率，但它們引起的副作用不容忽視。研發(fā)一種安全、有效降低非意愿妊娠率的避孕藥一直是計(jì)劃生育服務(wù)的熱點(diǎn)。適體是一類短序列單鏈核酸分子，通過折疊形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)而與靶分子有極高的特異性和親和力。適體分子因其合成簡(jiǎn)單，分子尺寸小，易進(jìn)行修飾，靶分子范圍廣泛，易從血液中清除等優(yōu)勢(shì)，在基礎(chǔ)研究、疾病的診斷和治療領(lǐng)域里具有極大的應(yīng)用潛能。本研究以人精子細(xì)胞為靶標(biāo)細(xì)胞，通過改良指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技

2、術(shù)（cell-SELEX技術(shù)）篩選出能與人精子細(xì)胞特異性結(jié)合、有高親和力的適體分子群，通過毛細(xì)管精子運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)評(píng)估所篩選的適體的抑精功能。
　　改良步驟包括連續(xù)強(qiáng)化的變異和漸趨苛刻的選擇。通過誘變PCR連續(xù)強(qiáng)化的變異，在擴(kuò)增文庫(kù)的同時(shí)增加文庫(kù)的多樣性；通過漸趨苛刻的選擇以提高候選序列入選率。采用Dot blotting和Eastern blotting作為檢測(cè)手段，檢測(cè)特異性抗人精子適體的富集程度。最后在第40輪的文庫(kù)中挑選

3、出與精子結(jié)合的候選克隆進(jìn)行鑒定、測(cè)序，獲得6條適體分子序列。
　　以挑選出的候選克隆為模板，利用 PCR和單鏈 DNA分離技術(shù)制備相應(yīng)的適體分子，對(duì)獲得的適體分子進(jìn)行Dot blotting檢測(cè)?；贒ot blotting檢測(cè)結(jié)果分析，挑選出與人精子蛋白特異性結(jié)合能力較強(qiáng)的兩條適體分子，即 Ap-8和Ap-9，進(jìn)行后續(xù)的Eastern blotting檢測(cè)和熒光檢測(cè)。上述三組檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明通過cell-SELEX篩選獲得的A

4、p-8和Ap-9兩條適體分子具有較強(qiáng)的特異性結(jié)合人精子細(xì)胞的能力。
　　參照《世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》內(nèi)毛細(xì)管測(cè)試實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)體外抑精運(yùn)動(dòng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。從所在課題組歷來(lái)建立的抗人精子的適體分子庫(kù)中挑選出20條適體分子進(jìn)行體外抑精運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2號(hào)適體Y1623rc1，10號(hào)適體a-2Rc，11號(hào)適體a-5，12號(hào)適體a-6Rc，13號(hào)適體a-12Rc，15號(hào)適體Ap-9和19號(hào)適體Ap-