基于抗耐藥菌活性的真菌次生代謝產物研究.pdf

1、細菌耐藥是本世紀全球關注的熱點問題，已成為嚴重的公共衛(wèi)生危機。細菌耐藥直接導致患者治療失敗、醫(yī)療費用增加、病死率上升，更為嚴重的是，耐藥菌的進一步發(fā)展可能使人類重新面臨感染性疾病的威脅。目前加強抗菌藥物研發(fā)是國內外對抗細菌耐藥的共識。真菌代謝產物的豐富性及其生物活性的多樣性是發(fā)現(xiàn)抗菌新藥的不竭動力。近年來，隨著生命科學的發(fā)展，與細菌耐藥發(fā)生的相關分子機制得以闡明，并且能在體外建立藥物的作用靶點模型進行大規(guī)模的藥物篩選，以及計算機虛擬分子

2、對接等新型技術手段的革新，再次掀起科學家們從微生物代謝產物中尋找抗耐藥菌先導化合物的熱潮。
　　本論文共分五個部分:
　　在第一部分中介紹了本課題的研究背景和立題依據(jù)，通過體外抑制耐藥菌活性篩選結合化學成分篩查的方法，從藥用植物（金線蓮；貫葉連翹；石蒜）以及長江灘涂中分離出的50株真菌中篩選出3株（Aspergillus sp.Z12，Aspergillus sp.TJ23和Emericella sp.TJ29）具有抗耐藥菌

3、活性并且代謝產物豐富的潛力菌株，為后續(xù)的次生代謝產物研究提供了資源菌株。
　　第二部分中通過抗菌活性導向分離，從真菌Aspergillus sp.Z12中分離鑒定了8個naphtho-γ-pyrone類化合物，首次測試了這些naphtho-γ-pyrone類化合物對耐藥菌的活性，發(fā)現(xiàn)fonsecinones A和C以及aurasperones A和E對6株耐藥菌具有潛在的抗菌活性。其中Fonsecinone A具有最強的抗菌活性，

4、對產超廣譜β-內酰胺酶的大腸埃希菌（ESBL-E.coli.），銅綠假單胞菌和糞腸球菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為4.26，17.04和4.26μg/mL。通過虛擬分子對接，微量熱泳動（MST）和酶抑制活性試驗首次發(fā)現(xiàn)并證實這些活性naphtho-γ-pyrones的抗菌靶點是細菌烯脂酰-ACP還原酶（FabI）。此外，這項研究也是成功使用計算機虛擬分子對接技術預測天然產物靶點的實例之一，為后續(xù)的天然產物的活性發(fā)現(xiàn)和靶點尋找奠定實踐基

5、礎。
　　第三部分中對Aspergillus sp.TJ23次生代謝產物進行了系統(tǒng)的研究，并對分離鑒定的部分化合物進行了抗耐藥菌和抗腫瘤活性的研究。從Aspergillus sp.TJ23大米固體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物中共分離鑒定了14個化合物，包括5個新化合物。新化合物為1個結構十分新穎的具有螺[雙環(huán)[3.2.2]壬烷-2,1′-環(huán)己烷]的新骨架雜萜，2個結構新穎的雜萜，1個甾體類化合物以及1個生物堿類化合物。通過單晶衍射實驗和大

6、量的量子化學計算，確定了所有化合物的絕對構型?？鼓退幘钚詼y試結果顯示新骨架化合物spiroaspertrione A具有一定的抗甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA）作用，并且能夠增效β-內酰胺類藥物甲氧西林對抗MRSA的能力，兩者聯(lián)合使用后可降低甲氧西林的MIC至1μg/mL。通過計算機模擬對接篩選，以及MST和Western Bolt實驗證實其作用靶點為青霉素結合蛋白PBP2a。此外，通過進行異檸檬酸脫氫酶1突變酶（IDH1R1

7、32H/R132C）活性篩選，新雜萜類化合物asperspiropene A在酶水平和細胞水平均表現(xiàn)出顯著活性。值得一提的是，該化合物是首個報道有IDH1R132H/R132C抑制活性的真菌代謝產物，可以作為新的靶向IDH1突變的抗腫瘤先導化合物進行深入研究。
　　第四部分中從Emericella sp.TJ29大米固體發(fā)酵的乙酸乙酯提取物中共分離鑒定了14個化合物，其中新化合物5個。新化合物包括3個結構新穎的雜萜，以及2個聚酮類

8、化合物。其中emervaridone A為“emervaridone雜萜骨架”的第二個化合物，并且是該碳骨架體系中，第一個H-7′為α-構象的化合物。通過單晶衍射實驗和量子化學計算，確定了所有新化合物的絕對構型。通過對部分化合物抗耐藥菌活性的測試，發(fā)現(xiàn)化合物emervaridone A以及varioxiranediol A具有較強的抗ESBL-E.coli.以及銅綠假單胞菌活性，并且對正常人支氣管上皮細胞無明顯毒性，具有繼續(xù)進行深入研究

9、的價值。
　　第五部分中對現(xiàn)今細菌耐藥時代下抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的策略和相關研究進展進行了綜述。從細菌耐藥的現(xiàn)狀，抗生素的發(fā)展歷史，細菌耐藥性形成及擴散機制，現(xiàn)代抗菌藥物的研發(fā)策略，以及未來抗菌藥物的發(fā)展方向五個方面進行深入探討并得出結論：天然產物仍然是發(fā)現(xiàn)新抗菌藥物的源泉。在現(xiàn)今細菌耐藥的時代里，可以運用新的計算機及生物技術等將細菌耐藥機制與基于結構的藥物發(fā)現(xiàn)方法相結合對天然產物進行篩選。同時，抗菌藥物的開發(fā)思路也需要革新—即從搜尋或開