板黨多糖對IEC-6細胞增殖分化機制的研究.pdf

1、板橋黨參系桔梗科植物川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根,因產于湖北恩施板橋鎮(zhèn)而得名,是益氣健脾的上乘良藥。已知它富含黨參多糖、黨參皂甙、甾醇類、三萜類成分及多種微量元素(如Fe、Mn、Zn、Se等)及人體不可缺少的氨基酸,是補氣血、養(yǎng)脾胃、潤肺生津、治療體虛的滋補佳品,位列全國“四大名黨”之首。
　　 采用苯酚硫酸法測定板黨多糖的含量,并對顯色條件進行了考察,確定了檢測波長為489nm,苯酚加入量為

2、1.5 mL,濃硫酸加入量為6.0 mL,在室溫下放置40 min為樣品多糖含量的最佳測定條件;同時對方法學也進行了考察,其精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、加樣回收率的RSD均＜2％,證明多糖含量測定方法的穩(wěn)定可靠;采用水提醇沉法提取板黨多糖,并經過石油醚脫脂,乙醇除小分子物質和脫色,savage法脫蛋白等一些純化過程得到了精制的板黨多糖,其含量為90.36%±1.12%,為后續(xù)的藥效學實驗提供了穩(wěn)定可靠的試藥。
　　 IEC-6細胞到

3、貨后在37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),三天傳代一次,傳至第十三代開始進行試驗,用MTT法發(fā)現(xiàn)250ug/mL、500ug/mL、1000ug/mL、2000ug/ml、4000ug/mL劑量組可以明顯促進IEC-6細胞增殖,并且對各劑量組板黨多糖作用后的各組吸光度值進行了方差分析,最終確定了板黨多糖對IEC-6細胞增殖作用的高中低劑量分別為250ug/mL、1000ug/mL、4000ug/mL;將對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板,待細胞長成

4、單層后,用小硅膠細胞刮輕刮單細胞層,產生約3mm2的圓形缺損區(qū),加入4000ug/mL板黨多糖溶液,對照組加入等量的完全培養(yǎng)液,分別于加藥后0h,24h,48h,72h倒置顯微鏡下觀察細胞移行情況發(fā)現(xiàn)4000ug/mL板黨多糖可以明顯更快的促進IEC-6細胞移行;用HE染色實驗,從形態(tài)學上觀察250ug/mL、1000ug/mL、4000ug/mL劑量組的板黨多糖作用后的細胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)多糖劑量組作用后的細胞有形成腺體的趨勢,而對照組沒有

5、,說明板黨多糖可以促進IEC-6細胞的分化;將細胞和培養(yǎng)基用細胞勻漿器勻漿,離心取上清得到ODC蛋白,按照EILSA試劑盒檢測其表達水平,結果為對照組細胞內ODC含量為(24.419±0.699)pg/mL,低劑量組為(29.419±0.941)pg/mL,中劑量組為(40.412±0.942)pg/mL,高劑量組為(45.271±0.620)pg/mL,表明板黨多糖可以明顯促進IEC-6細胞內0DC水平的提高;用半定量RT-PCR法檢