BVES對P19CL6心肌細(xì)胞分化和增殖作用的機制研究.pdf

1、目的：探討B(tài)VES對P19CL6心肌細(xì)胞分化及增殖的作用及其機制，為先天性心臟病的發(fā)病機制奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法：實驗采用P19C16細(xì)胞體外心肌細(xì)胞分化模型、1％DMSO可誘導(dǎo)其分化為成熟跳動的心肌細(xì)胞。含BVES基因片段的質(zhì)粒過表達(dá)P19CL6細(xì)胞上調(diào)內(nèi)源性BVES表達(dá)，BVES特異性siRNA轉(zhuǎn)染P19CL6細(xì)胞沉默內(nèi)源性BVES表達(dá)。qRT-PCR實驗定量檢測轉(zhuǎn)錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)、心臟基因

2、(MYH6、MYL7)、目的基因BVES和RhoA的mRNA表達(dá)水平，western blotting定量檢測心肌肌鈣蛋白(cTnT)蛋白水平表達(dá)，免疫熒光檢測心肌骨架蛋白MF20和Actinin蛋白水平表達(dá)。CCK-8實驗檢測細(xì)胞數(shù)量、EdU實驗檢測細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞流式檢測細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建P19CL6細(xì)胞體外心肌細(xì)胞分化模型，P19CL6細(xì)胞在含1％DMSO培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化12天后，免疫熒光染色顯示心肌細(xì)胞骨架蛋

3、白Actinin陽性細(xì)胞明顯增多，qRT-PCR顯示心臟轉(zhuǎn)錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)及心臟基因(MYL7、MYH6)的mRNA表達(dá)在P19CL6心肌細(xì)胞分化過程表達(dá)逐漸升高。BVES表達(dá)在P19CL6細(xì)胞心肌細(xì)胞分化過程被誘導(dǎo)表達(dá)。BVES質(zhì)粒可上調(diào)P19CL6細(xì)胞內(nèi)源性BVES蛋白和mRNA表達(dá)，BVES特異性siRNA可有效抑制P19CL6細(xì)胞內(nèi)源性BVES蛋白和mRNA表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果顯示過表達(dá)BVES可減

4、少P19CL6心肌細(xì)胞分化數(shù)量，qRT-PCR結(jié)果顯示過表達(dá)BVES抑制P19CL6心肌分化轉(zhuǎn)錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)及心臟基因(MYL7、MYH6) mRNA表達(dá)，western blotting結(jié)果顯示過表達(dá)BVES抑制心肌細(xì)胞分化晚期心肌肌鈣蛋白(cTnT)蛋白表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果顯示沉默BVES表達(dá)可增加P19CL6向心肌細(xì)胞分化數(shù)量，qRT-PCR結(jié)果顯示沉默BVES促進(jìn)P19CL6心肌分化心臟基因(MY

5、L7、MYH6) mRNA表達(dá)，但對P19CL6心肌細(xì)胞分化過程心臟轉(zhuǎn)錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)表達(dá)無影響，western blotting結(jié)果顯示沉默BVES表達(dá)可促進(jìn)分化晚期心肌肌鈣蛋白(cTnT)蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞學(xué)實驗顯示過表達(dá)BVES可抑制心肌細(xì)胞周期循環(huán)、使心肌細(xì)胞保持在G0/G1期，EdU結(jié)果顯示過表達(dá)BVES抑制心肌細(xì)胞DNA合成，CCK8結(jié)果顯示過表達(dá)BVES可減少心肌細(xì)胞增殖，但沉默BVES表達(dá)對心