人嬰兒期心肌細(xì)胞的增殖特征及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：0-12月的嬰兒期是出生后心臟發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。這段時(shí)期內(nèi)，嬰兒心臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了快速的變化，外在表現(xiàn)為心率從150次/分鐘減慢為80次/分鐘，而收縮壓則從55mmHg上升到100mmHg。死于先天性心臟病的患兒55.3%是發(fā)生在這段時(shí)期并且絕大部分復(fù)雜先天性心臟?。ㄈ绱髣?dòng)脈錯(cuò)位、肺動(dòng)脈閉鎖等）需要在新生兒或嬰兒早期手術(shù)。心肌細(xì)胞增殖關(guān)系到心臟的發(fā)育和手術(shù)后心臟的修復(fù)，是目前研究的熱點(diǎn)之一。然而，由于人體心肌組織標(biāo)本的

2、獲取困難，目前對(duì)于人心肌細(xì)胞的增殖的研究?jī)H有數(shù)篇報(bào)道，特別是對(duì)于嬰兒早期心肌細(xì)胞的增殖所知更少。本研究擬收集一歲內(nèi)的人心肌組織，觀察人嬰兒早期心肌細(xì)胞增殖的特征；并探討調(diào)控嬰兒心肌細(xì)胞增殖改變的內(nèi)在機(jī)理；在上述研究的基礎(chǔ)上，利用小分子化合物探索藥物促進(jìn)嬰兒早期心肌細(xì)胞增殖的可能；最后研究心肌細(xì)胞增殖在先天性心臟病外科手術(shù)中的意義。
　　方法：采用蘇木精-伊紅染色比較0-12月心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，利用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀

3、察Ki67陽(yáng)性和Aurora B陽(yáng)性心肌細(xì)胞的比例，明確嬰兒早期心肌細(xì)胞的增殖特征。利用Western Blot、Qrt-pcr、免疫熒光和免疫組化等方法觀察目前已知的關(guān)鍵性調(diào)控因子在人心肌細(xì)胞的表達(dá)情況；分離人心肌細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，觀察添加小分子化合物后，EdU陽(yáng)性和Ki67陽(yáng)性心肌細(xì)胞比例的改變；對(duì)小鼠行肺動(dòng)脈環(huán)縮術(shù)，超聲確定環(huán)縮效果，免疫熒光檢測(cè)右心室增殖的心肌細(xì)胞，Qrt-PCR檢測(cè)增殖肥大相關(guān)基因的改變。
　　結(jié)果：H

4、E染色顯示心肌細(xì)胞的平均體積隨年齡的增加而不斷加大。激光共聚焦顯微鏡顯示0-3月，4-6月和7-12月的Ki67陽(yáng)性心肌細(xì)胞的比例分別為0.55±0.02%、0.05±0.01%和0.02±0.005%，而Aurora B陽(yáng)性心肌細(xì)胞的比例分別為0.12±0.02%、0.01±0.01%和0.005±0.004%；流式細(xì)胞術(shù)顯示0-3月，4-6月和7-12月的Ki67陽(yáng)性心肌細(xì)胞的比例分別為0.47±0.16、0.07±0.02和0.0

5、2±0.01。Western-blot，免疫熒光和免疫組化顯示關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子 NICD和 YAP1表達(dá)隨著年齡的推移而減少，而β-catenin的表達(dá)隨年齡的增加而增加。嬰兒早期心肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)較易培養(yǎng)，小分子化合物CHIR99021可以明顯促進(jìn)嬰兒早期心肌細(xì)胞的增殖。小鼠肺動(dòng)脈環(huán)縮術(shù)后，增殖的心肌細(xì)胞明顯增加并且與增殖有關(guān)的基因也明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：0-3月的人心肌細(xì)胞具有十分突出的增殖能力，是嬰兒早期心肌細(xì)胞的特征之一；N