Wnt5b-BMSCs來源的Exosome影響心肌梗死區(qū)域血管發(fā)生的研究.pdf

1、目的：Wnt信號通路在細(xì)胞生命活動(dòng)中，尤其是在血管發(fā)育和血管發(fā)生過程中發(fā)揮極其重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Wnt5b基因過表達(dá)與沉默，然后提取各處理組SD大鼠BMSCs分泌在培養(yǎng)基上清中Exosome，采用基質(zhì)膠血管生成和大鼠心肌梗死模型，分別于體外體內(nèi)去驗(yàn)證不同處理組Exosome對血管生成情況的影響。
　　方法：分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組：Wnt5b基因沉默組（Wnt5b-siRNA-組）、空白對照組（NC組）、含Wnt5b基

2、因的質(zhì)粒過表達(dá)組（Wnt5b-PEX-1組）和PEX-1陽性對照組（PEX-1組）。取幼齡SD大鼠骨髓腔抽取骨髓，采用差異貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面分子標(biāo)記，如CD34、CD45、CD29和CD44。然后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入含有Wnt5b基因的質(zhì)粒和Wnt5b沉默siRNA，上調(diào)和抑制Wnt5b基因表達(dá)，采用Total Exosome Isolation試劑盒法提取培養(yǎng)基上清中的Exosome。體外實(shí)驗(yàn)中，我們采用

3、基質(zhì)膠血管生成法，用不同組來源的Exosome處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），于12小時(shí)、24小時(shí)觀察毛細(xì)血管管樣生成情況。培養(yǎng)心臟來源的內(nèi)皮細(xì)胞，將其分為兩組，分別用PEX-1陽性對照組來源的Exosome和Wnt5b-PEX-1過表達(dá)組的Exosome處理，約24-48小時(shí)后，應(yīng)用熒光半定量PCR去檢測VEGF-A、VEGF2R、TSP-1和Endostatin表達(dá)情況。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立SD大鼠心肌梗死模型后，將四個(gè)不同組來源

4、的Exosome行心肌內(nèi)注射，注射部位為心梗區(qū)域中心及周邊，4周后取出心臟，制作心肌組織切片，免疫熒光標(biāo)記后觀察心梗及周邊區(qū)域的血管再生情況。
　　結(jié)果：采用全骨髓差異貼壁法分離BMSCs，原代貼壁細(xì)胞鏡下主要呈圓形，之后傳代培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞體積逐漸增大，大部分呈紡錘形或梭形，形似成纖維細(xì)胞，流式鑒定細(xì)胞表面抗原CD34、CD45陰性，CD29、CD44陽性，陽性率分別達(dá)99.4％和99%，故BMSCs純度很高。提取BMSCs來源的

5、Exosome電鏡下平均直徑為（47.52±11.84）nm，流式鑒定CD63陽性率達(dá)91%，免疫蛋白印跡陽性，符合Exosome生物學(xué)特性。Wnt5b與Wnt5b-siRNA轉(zhuǎn)染成功后，提取不同處理組Exosome，在體外成管實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)Image J軟件分析，Wnt5b-PEX-1組體外管樣結(jié)構(gòu)連接長度與Wnt5b-siRNA組、PEX-1組和NC組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在Exosome與心臟內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，應(yīng)用熒光半定量

6、PCR檢測VEGF-A、VEGF2R、TSP-1和Endostatin表達(dá)情況。Wnt5b-PEX-1組與PEX-1陽性對照組VEGF-A和VEGF2R的mRNA表達(dá)量存在顯著差異。而TSP-1和Endostatin的mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；體內(nèi)試驗(yàn)中，用Griffonia(Bandeiraea)Simplicifolia lectin1標(biāo)記心梗周邊組織內(nèi)皮細(xì)胞行免疫熒光檢測，心梗區(qū)域及其周邊功能性毛細(xì)血管密度分析結(jié)果顯示W(wǎng)nt5b