硅酸二鈣顆粒-涂層對單核-巨噬細(xì)胞的促炎作用和成骨效應(yīng)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一章:硅酸二鈣顆粒對人外周血單核細(xì)胞、人單核細(xì)胞系THP-1、人成骨細(xì)胞系MG-63的細(xì)胞毒性作用
　　制備硅酸二鈣顆粒，對硅酸二鈣顆粒和羥基磷灰石顆粒進(jìn)行表征分析。如顆粒掃描電鏡分析、顆粒表面元素分析、顆粒粒徑分析及比表面積分析。掃描電鏡可見兩種材料的顆粒大小和形狀不同。表面元素分析可見硅酸二鈣顆粒中含有Ca、Si、O等元素;羥基磷灰石顆粒Ca5(PO4)3(OH)含有Ca、Si、P

2、、O等元素，與材料應(yīng)含有的元素相符。X-射線衍射分析可見樣品的X-射線衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)品衍射峰相吻合，說明樣品的物相較純。激光衍射粒徑分析見硅酸二鈣顆粒的粒徑范圍是3～22μm，羥基磷灰石是1.9～80μm。兩種材料的比表面積分析可見兩種材料的比表面積不同。通過計(jì)算比表面積比，臺(tái)盼藍(lán)染色，CCK-8和細(xì)胞凋亡檢測不同比表面積比（10/1，5/1和1/1）顆粒對免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。在本研究中選擇了人外周血單核細(xì)胞，THP-1以及MG-63

3、作為研究對象。單核細(xì)胞是首先與生物材料接觸的細(xì)胞，種植體涂層脫落的顆?；蛘吖撬嘀踩塍w內(nèi)后，單核細(xì)胞首先聚集在這些材料所在的部位，單核細(xì)胞吞噬這些顆粒后可能出現(xiàn)細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。硅酸二鈣作為種植體涂層材料或者骨替代材料，主要與骨細(xì)胞發(fā)生相互作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化。所以在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了最常用的MG-63作為實(shí)驗(yàn)對象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)硅酸二鈣顆粒對人外周血單核細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性作用。CCK-8分析結(jié)果可見，硅酸二鈣和羥基磷灰

4、石對三種細(xì)胞均無明顯的細(xì)胞毒性作用，材料與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h和48 h后均有85％以上細(xì)胞為活細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，人外周血單核細(xì)胞與硅酸二鈣共培養(yǎng)24 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為95.38±3.79％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為93.88±4.67％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在98.05±1.39％，細(xì)胞毒性分級為1級。人外周血單核細(xì)胞與羥基磷灰石顆粒共培養(yǎng)24 h后，SAR10∶1的細(xì)胞

5、存活率為90.00±7.61％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為94.93±2.08％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在91.73±3.74％，細(xì)胞毒性分級為1級。人外周血單核細(xì)胞與硅酸二鈣共培養(yǎng)48 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為88.48±11.79％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為88.17±9.57％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在92.81±18.52％，細(xì)胞毒性

6、分級為1級。而人外周血單核細(xì)胞與羥基磷灰石共培養(yǎng)48 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為91.94±24.37％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為95.95±6.50％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在95.36±23.85％，細(xì)胞毒性分級為1級。共培養(yǎng)24 h時(shí)硅酸二鈣組的細(xì)胞存活率均高于羥基磷灰石的存活率，而共培養(yǎng)48 h后硅酸二鈣組的細(xì)胞存活率低于羥基磷灰石組，但所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率均在85％以上。

7、r>　　THP-1與硅酸二鈣顆粒共培養(yǎng)24 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為89.10±13.02％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為84.44±12.86％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在86.85±20.41％，細(xì)胞毒性分級為1級。THP-1與羥基磷灰石顆粒共培養(yǎng)24 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為99.23±27.40％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為97.14±7.88％，細(xì)胞

8、毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在91.44±28.56％，細(xì)胞毒性分級為1級。人單核細(xì)胞系THP-1與硅酸二鈣顆粒共培養(yǎng)48 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為92.03±3.68％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為98.49±7.00％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在109.52±3.06％，細(xì)胞毒性分級為0級。THP-1與羥基磷灰石顆粒共培養(yǎng)，48 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為105.2

9、4±2.39％，細(xì)胞毒性分級為0級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為110.01±6.95％，細(xì)胞毒性分級為0級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在103.46±2.45％，細(xì)胞毒性分級為0級。提示低劑量的硅酸二鈣顆粒和羥基磷灰石顆粒能刺激THP-1細(xì)胞增殖。
　　MG-63與硅酸二鈣顆粒共培養(yǎng)24 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為125.57±8.90％，細(xì)胞毒性分級為0級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為119.59±11.32％，細(xì)胞毒性分級

10、為0級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在108.36±3.06％，細(xì)胞毒性分級為0級。MG-63與羥基磷灰石顆粒共培養(yǎng)24 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為120.09±9.15％，細(xì)胞毒性分級為0級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為110.06±5.43％，細(xì)胞毒性分級為0級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在119.73±15.20％，細(xì)胞毒性分級為0級。MG-63與硅酸二鈣顆粒共培養(yǎng)48 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為87.05±1.35％，細(xì)

11、胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為95.88±3.16％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在93.86±3.30％，細(xì)胞毒性分級為1級。MG-63與羥基磷灰石顆粒共培養(yǎng)48 h后，SAR10∶1的細(xì)胞存活率為84.50±4.00％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR5∶1的細(xì)胞存活率為88.60±6.14％，細(xì)胞毒性分級為1級;SAR1∶1的細(xì)胞存活率在95.59±4.06％，細(xì)胞毒性分級為1級。提示硅酸二鈣和羥基磷灰石顆

12、粒在24 h內(nèi)對成骨細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)，而48 h后細(xì)胞增殖有一定變化，但細(xì)胞存活率仍在85％以上。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同比表面積比(SARs)的硅酸二鈣顆粒/羥基磷灰石顆粒對人外周血單核細(xì)胞凋亡的影響。人外周血單核細(xì)胞與硅酸二鈣/羥基磷灰石共培養(yǎng)后，SAR10∶1的細(xì)胞凋亡率為分別為6.16±0.77％和5.29±0.48％。硅酸二鈣引起較大的細(xì)胞凋亡比例，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但硅酸二鈣組

13、與羥基磷灰石組兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。SAR5∶1的細(xì)胞凋亡率為分別為5.49±0.48％和7.25±1.48％。羥基磷灰石引起較多的細(xì)胞凋亡比例，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但硅酸二鈣組與羥基磷灰石組兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SAR1∶1的細(xì)胞凋亡率分別為4.96±0.079％和4.32±1.30％。硅酸二鈣組/羥基磷灰石組與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，硅酸二鈣組與

14、羥基磷灰石組兩組間比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　THP-1與硅酸二鈣/羥基磷灰石共培養(yǎng)后，SAR10∶1的細(xì)胞凋亡率為分別為8.88±0.77％和6.03±1.45％。硅酸二鈣引起較大的細(xì)胞凋亡比例，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，硅酸二鈣組與羥基磷灰石組兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SAR5∶1的細(xì)胞凋亡率為分別為5.83±0.72％和6.32±0.75％。硅酸二鈣/羥基磷灰石與對照組比較

15、均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，硅酸二鈣組與羥基磷灰石組兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SAR1∶1的細(xì)胞凋亡率為分別為5.98±0.48％和4.46±1.53％。硅酸二鈣組/羥基磷灰石組與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，硅酸二鈣組與羥基磷灰石組兩組間比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)果表明硅酸二鈣顆粒是相對較安全的生物材料。
　　第二章:硅酸二鈣顆粒的體外促炎作用和成骨效應(yīng)
　　細(xì)胞外基質(zhì)降解

16、是評價(jià)生物材料安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是評估炎癥細(xì)胞對生物材料的反應(yīng)。為了探索硅酸二鈣顆粒/羥基磷灰石顆粒對THP-1細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶類以及腫瘤壞死因子-α等的影響，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光定量RT-PCR法分析基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-2和MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-2和TIMP-1）的表達(dá)情況。
　　對TNF-α mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，6h和24 h時(shí)，脂

17、多糖和酵母多糖均引起高水平的TNF-α表達(dá)。6h時(shí)，硅酸二鈣組和羥基磷灰石組均未引起明顯的TNF-α表達(dá)變化。24 h后，硅酸二鈣組和羥基磷灰石組均上調(diào)TNF-α表達(dá)(P＜0.05)，但與羥基磷灰石組相比，硅酸二鈣組的上調(diào)幅度較小，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　由研究結(jié)果可見，硅酸二鈣可能比羥基磷灰石相對安全，引起的促進(jìn)炎癥效應(yīng)較弱。硅酸二鈣和羥基磷灰石均對LPS激活細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)無調(diào)節(jié)作用。硅酸二鈣和羥基磷

18、灰石具有相似的成骨效應(yīng)。
　　第三章:硅酸二鈣涂層對鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的細(xì)胞毒性研究 本研究將RAW264.7與硅酸二鈣涂層共培養(yǎng)，通過細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測硅酸二鈣涂層對264.7的細(xì)胞毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示硅酸二鈣涂層/生物玻璃45S5涂層對RAW264.7無細(xì)胞毒性，屬毒性分級1級。
　　本研究證明硅酸二鈣顆粒及涂層是一種生物安全性較高的生物材料，其體外促進(jìn)炎癥因子分泌的能力可能比羥基磷灰石弱，提示其