skMLCK及CaM在LPS誘導(dǎo)的ARDS導(dǎo)致膈肌收縮力下降中的作用.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:通過(guò)腹腔內(nèi)注射LPS(Lipopolysaccharide)構(gòu)建大鼠急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome ARDS)動(dòng)物模型,采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合式酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)ARDS導(dǎo)致大鼠膈肌收縮力下降中骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶(skeletal muscle light chain kinase skMLCK)及鈣調(diào)蛋白(calmodulin CaM

2、)mRNA的表達(dá)水平的變化及其是否與誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān)。同時(shí)將skMLCK mRNA及CaM mRNA的表達(dá)水平與前期工作基礎(chǔ)測(cè)得的膈肌收縮力進(jìn)行相關(guān)性分析,初步研究skMLCK及CaM mRNA表達(dá)水平的變化是否在LPS誘導(dǎo)ARDS導(dǎo)致膈肌收縮力下降中的發(fā)揮作用,并進(jìn)一步探討ARDS導(dǎo)致呼吸衰竭膈肌收縮力下降的分子機(jī)制。
  方法:將32只健康且月齡在2月±1周的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(250±20)g隨機(jī)分為對(duì)

3、照組及實(shí)驗(yàn)組,每組大鼠均為8只(n=8)。其中對(duì)照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水(10ml/day),實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射LPS(8mg/kg/day)并將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為24h組、48h組及7d組。其中,LPS24h組在腹腔內(nèi)注射LPS后觀察24h;LPS48h組腹腔注射LPS,24h后再次向大鼠腹腔注射LPS共觀察48h;7d組腹腔注射LPS后觀察24h后再腹腔注射LPS共觀察7天。在構(gòu)建ARDS動(dòng)物模型期間分別觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)及一

4、般狀態(tài)(呼吸、血壓等)等情況并記錄。所有組別大鼠待觀察實(shí)驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束后于10%水合氯醛(3ml/100g)腹腔麻醉后,抽取各組大鼠頸動(dòng)脈血測(cè)定血?dú)獠⒂?jì)算氧合指數(shù)。迅速取出各組大鼠膈肌組織并將其剪成60mg左右大小膈肌條置于EP管中,并置于-80℃冰箱保存。待膈肌取出后,用加入肝素的生理鹽水經(jīng)右心室注入肺動(dòng)脈內(nèi)對(duì)肺血管床進(jìn)行沖洗,最終取出各組大鼠肺組織,每只大鼠均取出右肺上葉測(cè)量干濕重并計(jì)算濕/干重比,留取剩余肺組織部分于-80℃保存,部分于

5、組織固定液中固定。最終應(yīng)用蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin HE)染色在光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合式酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法分別測(cè)定各組大鼠膈肌組織skMLCK及CaM mRNA表達(dá)水平并與對(duì)照組進(jìn)行比對(duì),最終通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件運(yùn)用相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。
  結(jié)果:1. ARDS動(dòng)物模型:
  1.1.大鼠行為學(xué)表現(xiàn):
  1.1.

6、1.對(duì)照組大鼠一般狀態(tài)良好,飲食、飲水正常,毛發(fā)發(fā)育正常,活動(dòng)力強(qiáng),呼吸及血壓平穩(wěn)。
  1.1.2 LPS各實(shí)驗(yàn)組的大鼠腹腔注射LPS后均出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)無(wú)光澤、反應(yīng)遲鈍、厭食、厭水、畏寒、呼吸急促及血壓降低等表現(xiàn)。
  1.1.2.1.呼吸頻率:LPS各實(shí)驗(yàn)組大鼠呼吸頻率明顯比對(duì)照組增快且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS各實(shí)驗(yàn)亞組之間呼吸頻率差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
  1.1.2.2.平

7、均動(dòng)脈壓(MAP):LPS各實(shí)驗(yàn)組大鼠平均動(dòng)脈壓明顯比對(duì)照組降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS各實(shí)驗(yàn)亞組之間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
  1.2.氧合指數(shù)(PO2/FiO2):LPS各實(shí)驗(yàn)組大鼠氧合指數(shù)明顯比對(duì)照組降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS各實(shí)驗(yàn)亞組之間氧合指數(shù)差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
  1.3肺損傷評(píng)分:LPS各實(shí)驗(yàn)組肺組織損傷評(píng)分較對(duì)照組明顯升高且差異具有

8、明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS各實(shí)驗(yàn)亞組之間肺損傷評(píng)分比較差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),48h肺損傷評(píng)分最高,表明在48h可能對(duì)肺組織的損傷最重,7d組肺損傷評(píng)分較24h低,表明在7d時(shí)可能出現(xiàn)逐漸恢復(fù)的過(guò)程。
  1.4膈肌收縮功能:
  1.4.1.等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA):LPS各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,LPS各實(shí)驗(yàn)組(Pt/CSA)下降且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

9、r>  1.4.2.最大強(qiáng)直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA):LPS各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,LPS各實(shí)驗(yàn)組(P0/CSA)下降且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
  2、膈肌skMLCK mRNA表達(dá):LPS各實(shí)驗(yàn)組膈肌skMLCK mRNA表達(dá)均比對(duì)照組低且差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LPS各亞組間(LPS24h、LPS48h、LPS7d組)膈肌skMLCK mRNA表達(dá)差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

10、,即與LPS誘導(dǎo)時(shí)間無(wú)關(guān)。
  3、 skMLCK mRNA的表達(dá)及膈肌收縮力進(jìn)行相關(guān)性分析。將skMLCK mRNA表達(dá)與等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA)進(jìn)行相關(guān)性分析,得出膈肌skMLCK mRNA的低表達(dá)與膈肌等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.53 P<0.05);將膈肌skMLCK mRNA的表達(dá)與最大強(qiáng)直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)進(jìn)行相關(guān)性分析,得出膈肌skMLC

11、K mRNA的低表達(dá)與最大強(qiáng)直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)兩者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.57 P<0.05)。
  4、 CaM mRNA的表達(dá):與對(duì)照組相比,LPS各實(shí)驗(yàn)組膈肌CaM mRNA的表達(dá)均比對(duì)照組高,差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組之間(LPS24h、LPS48h、LPS7d組)膈肌CaM mRNA表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),即與LPS誘導(dǎo)時(shí)間無(wú)關(guān)。
  5、 CaM mRNA的表

12、達(dá)及膈肌收縮力進(jìn)行相關(guān)性分析。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0對(duì)CaM mRNA的表達(dá)及膈肌收縮力進(jìn)行相關(guān)性分析。將CaM mRNA的表達(dá)與等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA)進(jìn)行相關(guān)性分析,得出膈肌CaMmRNA的高表達(dá)與膈肌等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/C SA)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.41 P<0.05)。將膈肌CaM mRNA的高表達(dá)與最大強(qiáng)直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)進(jìn)行相關(guān)性分析,得出膈肌CaM m

13、RNA的高表達(dá)與最大強(qiáng)直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.43 P<0.05)。
  6、 skMLCK mRNA與CaM mRNA表達(dá)的相關(guān)性
  通過(guò)對(duì)膈肌CaM及skMLCK mRNA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果提示:膈肌CaM mRNA的高表達(dá)與skMLCK mRNA的低表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.49 P<0.05)。
  結(jié)論:skMLCK mRNA的低表達(dá)及CaM mRNA的高表達(dá)

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