豚鼠腸黏膜屏障與膽色素結石關系的實驗研究.pdf

1、膽石癥目前在世界上仍然是常見病、多發(fā)病之一。在我國臨床實踐中，膽固醇結石好發(fā)于膽囊，膽色素結石好發(fā)于肝膽管系統(tǒng)，尤以肝內膽管常見(占90％以上)。膽囊結石可手術切除而治愈，但膽管結石療效尚不滿意，表現為手術后結石殘余率、復發(fā)率高，手術并發(fā)癥發(fā)生率和再手術率較高，那么研究膽色素結石的發(fā)病原因以及預防就有了實際的意義。早在20世紀50年代就有報道肝內膽管結石源于細菌感染，可伴膽管狹窄，致病情反復難愈。膽石癥病人膽汁中細菌的檢出率高提示了細菌

2、感染和膽色素結石形成之間有密切的關系。但細菌的來源說法不一，有血源性、返流性、移位性多種學說，可能同時并存。我們在近期對膽色素結石的研究工作中注意到，飲食誘導的豚鼠膽囊膽色素結石形成過程中，腸黏膜屏障中機械屏障及腸黏膜通透性方面存在異常，這一點提示我們，腸黏膜屏障功能異常在膽色素結石形成的某些環(huán)節(jié)中發(fā)揮一定的作用。遵循這一邏輯思維，鑒于門靜脈系統(tǒng)的特殊解剖結構，當腸黏膜屏障功能發(fā)生異常時，腸道內的細菌是否在某些因素的作用下，透過腸壁、通

3、過血液和淋巴管道，侵及肝膽系統(tǒng)，進而促進膽色素結石的形成。基于以上想法，我們在飲食誘導的豚鼠膽囊膽色素結石模型中，用細菌分類培養(yǎng)的方法，觀察腸道內細菌菌群數量的變化；用免疫組化的方法，觀察腸黏膜免疫細胞和分子數量的變化，借此反應腸黏膜免疫功能，并進一步應用腸黏膜保護劑谷氨酰胺進行干預。從正反二個方面，來觀察腸黏膜屏障功能與膽色素結石形成之間的關系，從一個新的角度來初步探討膽色素結石的形成機制和可能的預防手段。 實驗方法：

4、 一、實驗對象 豚鼠95只，雌性48只，雄性47只，體質量210～250g，適應性飼養(yǎng)一周后，按照隨機原則分為四組：對照組(CON組)15只，給予普通豚鼠飼料，飼養(yǎng)8周；致石組(PS組)30只，給予致石飼料，飼養(yǎng)8周；短期致石組(STPS組)20只，給予致石飼料，飼養(yǎng)4周；谷氨酰胺組(GLN組)30只，給予添加谷氨酰胺的致石飼料，飼養(yǎng)8周。各組均處于相同的飼養(yǎng)條件下，投餌量一致。 二、標本采集 1、膽囊膽色素結石

5、標本以10％水合氯醛按照3ml/kg腹腔注射麻醉后，將豚鼠固定于解剖臺，腹部高效碘消毒，取腹部正中切口開腹，含膽汁取下膽囊，囊內膽汁及膽石可憑肉眼清晰辨別，采用雙盲法操作并記錄成石情況。 2、回腸內容物及回腸病理標本開腹后，尋找到回盲部，取末端回腸2cm，縱向剖開，收集腸內容物后，稱重、放入無菌小瓶中?；啬c標本用生理鹽水清洗三遍，用剪刀裁成1cm長的小段，用10％的中性福爾馬林浸泡。每操作一個豚鼠更換一套無菌手術器械。

6、三、檢測指標 1、致石率評定及紅外光譜結石定性解剖顯露豚鼠膽囊，肉眼即可清晰辨別膽囊結石形成情況，采用紅外光譜溴化鉀壓片法，對結石成分進行定性，統(tǒng)計結石形成率。 2、豚鼠回腸內容物細菌分類培養(yǎng)取回腸內容物，依濃度稀釋后在腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌培養(yǎng)基上進行需氧和厭氧培養(yǎng)，并計數。 3、計算腸道細菌定植抗力雙歧桿菌與腸桿菌的數量比值(B/E值)。 4、豚鼠腸黏膜免疫細胞和分子檢測采用免疫組化法，測定

7、腸黏膜內抗原遞呈細胞、B細胞、漿細胞的數量和腸黏膜表面SIgA的含量。 實驗結果： 1、豚鼠膽囊膽色素結石模型構建情況飼養(yǎng)8周后，CON組豚鼠偶見結石形成，PS組成石率為68.42％，GLN組成石率為38.89％，GLN組低于PS組(p<0.05)，另飼養(yǎng)4周的STPS組成石率為36.36％，低于PS組(p<0.05)。結石定性為膽色素結石。 2、豚鼠回腸內容物細菌分類培養(yǎng)結果與CON組相比，PS組腸桿菌、腸球菌

8、的量明顯升高，乳桿菌、雙歧桿菌的量明顯降低(p<0.05)；STPS組腸桿菌的量明顯升高，雙歧桿菌的量明顯降低(p<0.05)；GLN組雙歧桿菌的量明顯降低(p<0.05)。 3、腸道細菌定植抗力與CON組B/E值(1.770±65)相比，致石組B/E值(1.33±0.31)降低(p<0.05)。 4、豚鼠腸黏膜免疫細胞和分子檢測與CON組相比，STPS組腸黏膜固有層內DC細胞數增加，抗原表達增強、增多(p<0.05)；