豌豆膽色素原脫氨酶新型表達載體構建與定點突變.pdf

1、　　所有卟啉類化合物生物合成共有途徑由三個酶催化，它們分別是5-氨基酮戊酸脫水酶(ALAD)，膽色素原脫氨酶(ilinogendeaminase，PBGD)和尿卟啉原Ⅲ合酶。PBGD是共有途徑的調控酶。為研究豌豆膽色素脫氨酶在大腸桿菌的高效表達，本實驗構建了PBGD的T5啟動子下的雙標簽表達載體pQE30PBGD和T7啟動子下的雙標簽表達載體p28PBGD，雙標簽分別為組氨酸標簽和抗鏈霉素蛋白短肽標簽。為確定酶的保守氨基酸殘基Ala18

2、8對酶活的貢獻，本實驗將Ala188突變成Ser188，測序驗證。為防止PBGD催化的產物尿卟啉原Ⅰ毒害轉化細胞，將枯草桿菌UROS的表達載體和p28PBGD共轉化。為調控PBGD的表達，我們又將合成膽色素原(PBGD輔基成分)的5-氨基酮戊酸脫水酶的表達載體和p28PBGD共轉化。分別誘導表達p28PBG/pA-ALAD和p28PBGD/pA-UROS，Ni-NTA親和層析柱純化。結果如下：1.構建了T5啟動子下的pQE30sPBGD

3、和T7啟動子下的p28PBGD表達載體，表達重組豌豆膽色素脫氨酶，它的C-端含有8個氨基酸短肽的strep標簽，N-端含有組氨酸標簽。2.定點突變膽色素原脫氨酶保守氨基酸A188S。3.分別將膽色素原脫氨酶的上游和下游的兩個酶5-氨基酮戊酸脫水酶和尿卟啉原Ⅲ合酶，插入pET-3a，再將酶切的含T7啟動子和RBS序列的兩個酶的基因序列插入pCYC184中。4.S分別誘導表達p28PBG/pA-ALADBL21(DE3)和p28PBGD/p