大腸桿菌蘇氨酸脫氨酶變構(gòu)調(diào)控的理性設(shè)計(jì)與改造.pdf

1、生物合成型蘇氨酸脫氨酶（TD）是異亮氨酸（Ile）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，受終端產(chǎn)物Ile的反饋抑制及競爭途徑產(chǎn)物纈氨酸（Val）的激活。解除Ile對(duì)TD的反饋抑制對(duì)Ile生產(chǎn)至關(guān)重要，但是Ile和Val在TD的結(jié)合位點(diǎn)尚不清楚，而這對(duì)理性設(shè)計(jì)TD構(gòu)建非Ile敏感性突變體是非常必要的。
　　基于大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶、擬南芥的天冬氨酸激酶1及大腸桿菌TD的ACT-domain結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了Ile和Val在TD上可能的結(jié)

2、合位點(diǎn)。根據(jù)氨基酸的保守性選擇了其中的14個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，并對(duì)這些突變體進(jìn)行了Ile及Val敏感性分析和酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究。研究結(jié)果表明每一個(gè)TD單體都有兩個(gè)非等價(jià)的效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)：位點(diǎn)A包括殘基R362、E442、G445、A446、R466和H468；位點(diǎn)B包括殘基E347、G350、F352、Y369、I460和S461，都與Ile相互作用，其中E347、G350和F352也參與結(jié)合Val。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果，本論文中提議了一種

3、基于變構(gòu)效應(yīng)物Ile和Val濃度控制的調(diào)控機(jī)制。
　　根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的研究結(jié)果，理性設(shè)計(jì)并構(gòu)建出的5個(gè)TD雙位點(diǎn)突變體對(duì)Ile敏感性顯著減弱，證明了結(jié)合位點(diǎn)的研究對(duì)于理性設(shè)計(jì)Ile非敏感型TD突變體具有重要的指導(dǎo)意義。其中，TDR362F/I460F相對(duì)于野生型TD對(duì)Ile的抗性至少提高了700倍，甚至完全解除了Ile的反饋抑制，且無效應(yīng)物時(shí)兩者的酶活水平相當(dāng)；TDF352A/R362F不僅酶活水平提高，對(duì)底物親和力更強(qiáng)，而且對(duì)Il

4、e的敏感性減弱非常顯著。在大腸桿菌JW3591中過表達(dá)該突變體比過表達(dá)野生型TD或TdcB能顯著增加Ile和2-酮丁酸的生產(chǎn)。從酶學(xué)的角度講，TD突變體TDR362F/I460F和TDF352A/R362F對(duì)開發(fā)Ile或其他以2-酮丁酸為前體的化合物的高產(chǎn)菌株具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
　　為了探討TD調(diào)控域作為調(diào)控元件用于蛋白質(zhì)調(diào)控性能改造的可行性，我們將TD的調(diào)控域移植到與TD催化域結(jié)構(gòu)高度相似的生物降解型蘇氨酸脫氨酶（TdcB）上