載脂蛋白A-I的在LTA誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷及膿毒血癥中的治療作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用改良的冷乙醇沉淀法,從血漿F-Ⅳ組分中提取純化人血漿載脂蛋白A-I(ApoA-I),經(jīng)聚乙二醇濃縮后,用150 mmol/L磷酸緩沖液透析,得到可用于實(shí)驗(yàn)用純化的ApoA-I。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法(westernblot)鑒定分離得到的蛋白為純化的ApoA-I。對(duì)LTA激活的巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性抑制作用的實(shí)驗(yàn)顯示,制備得到的ApoA-I具有生物活性。
　　 用磷脂壁酸(LTA)激

2、活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,加入不同濃度ApoA-I(終濃度分別為0,10,50,100μg/ml)共同培育,3小時(shí)后將巨噬細(xì)胞上清液加到L-929細(xì)胞中,MTT法檢測(cè)LTA激活的巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子對(duì)L-929細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明,ApoA-I顯著降低LTA激活的巨噬細(xì)胞造成的L-929細(xì)胞的死亡率,且這種作用具有劑量效應(yīng):LTA組L-929細(xì)胞死亡率為(51.32±5.06)％,10μg/ml ApoA-I+LTA組L-929細(xì)胞死亡

3、率為(46.33±1.95)％,50μg/mlApoA-I+LTA組L-929細(xì)胞死亡率為(33.10±2.71)％(P<0.01),100μg/ml Apo A-I+LTA組L-929細(xì)胞死亡率為(29.62±1.36)％(P<0.01),50μg/mlApo A-I+10％LFF+LTA組L-929細(xì)胞死亡率為(15.73±0.65)％(P<0.01),ITA+10％LFF組L-929細(xì)胞死亡率為(45.47±5.06)％。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)

4、明,ApoA-I可以明顯抑制LTA激活的巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,且ApoA-I的作用具有劑量效應(yīng),而且,10％無(wú)脂蛋白血漿本身沒(méi)有抑制LTA激活巨噬細(xì)胞的功能,卻可以加強(qiáng)ApoA-I的保護(hù)功能。
　　 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用LTA激活,并且同時(shí)給予ApoA-I處理,37℃培養(yǎng)48小時(shí)后,PBS清洗并用4％的甲醛固定15分鐘,封閉液處理一小時(shí)后加入分別加入NF-κB p65抗體,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗,置于熒光顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)與

5、對(duì)照組相比,給予ApoA-I后LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NFκB激活和核轉(zhuǎn)位可以被抑制。
　　 給小鼠腹腔注射LTA,造成膿毒血癥后,尾靜脈注射ApoA-I進(jìn)行治療(對(duì)照組注射生理鹽水)。觀察24小時(shí)后,取血和肺灌洗液,測(cè)定白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。同時(shí),取小鼠肺組織做病理切片,觀察組織病理變化。結(jié)果表明,ApoA-I能夠顯著降低血漿中IL-1β和TNF-α的水平:對(duì)照組中IL-1β和TNF-α的

6、濃度分別為(217.33±19.31)pg/ml和(86.94±20.17)pg/ml,ApoA-I治療組中IL-1β和TNF-α的濃度分別為(86.88±17.58)pg/ml(P<0.01)和(59.66±20.33)pg/ml(P<0.05)。同時(shí),ApoA-I能夠顯著降低肺灌洗液中IL-1β和TNF-α的水平:對(duì)照組中IL-1β和TNF-α的濃度分別為(182.50±23.24)pg/ml和(69.41±9.81)pg/ml,A

7、poA-I治療組中IL-1β和TNF-α的濃度分別為(150.25±13.67)pg/ml(P<0.01)和(45.75±7.57)pg/ml(P<0.01)。另外,組織病理分析表明,ApoA-I可以減輕LTA誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷及炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果說(shuō)明ApoA-I在LTA誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中具有良好的治療作用。
　　 將ApoA-I和LTA的混合物分別用考馬斯亮蘭和蘇丹黑染色后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)兩種染色均只有同樣位置的

8、一條條帶,說(shuō)明ApoA-I和LTA在體外也可以直接結(jié)合。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
　　 1、ApoA-I在LTA誘導(dǎo)的小鼠系統(tǒng)性炎癥和急性肺損傷中具有良好的治療作用；
　　 2、ApoA-I在小鼠敗血癥中具有良好的治療作用；
　　 3、AooA-I可能通過(guò)兩條途徑抑制巨噬細(xì)胞激活:(1)細(xì)胞外結(jié)合并中和LTA,阻斷LTA對(duì)巨噬細(xì)胞的激活；(2)細(xì)胞內(nèi)阻斷激活的巨噬細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路(NFκB的激活和核轉(zhuǎn)