大鼠最后區(qū)SOX2、Nestin、BrdU陽性細胞的形態(tài)學觀察.pdf

1、目的：本研究通過采用免疫組化染色和免疫組化熒光染色的方法觀察SOX2、Nestin和BrdU陽性細胞在最后區(qū)的分布。
　　方法：健康SD大鼠，6-8周齡，雄性，體重150－180克，12只，清潔級，其中6只制備BrdU模型。由河北醫(yī)科大學動物中心提供。
　　1 BrdU模型制備
　　1.1配制BrdU生理鹽水注射液：20毫克/毫升，用分析天平量取BrdU450毫克溶于22.5毫升生理鹽水注射液。將配制好的生理鹽水注射液

2、放入45℃恒溫干燥箱中使其充分溶解。溶解后，4℃保存。
　　1.2注射：采用上述配制完畢的BrdU生理鹽水注射液，按照每只50毫克/千克對實驗動物進行腹腔注射。連續(xù)三天給藥，每天兩次，間隔兩個小時。注射時間段為下午14時－16時。
　　2光鏡免疫組化石蠟標本制備：常規(guī)經(jīng)心灌注、固定、取腦，冠狀方向去除從第四腦室外側隱窩以前腦組織，然后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片，片厚5um。常規(guī)甲苯胺藍尼氏染色、SOX2免疫組化染色、Nest

3、in免疫組化染色、BrdU免疫組化染色封片。顯微鏡觀察、照相。
　　3光鏡免疫組化冰凍標本制備：麻醉、灌注、后固定的方法同光鏡免疫組化石蠟標本，后固定結束后將相應組織塊蒸餾水沖洗后放入15％蔗糖溶液至組織塊沉入溶液底部，換入30％蔗糖溶液至組織塊沉入溶液底部。參照大鼠腦切片圖譜，選取包含有最后區(qū)的部分，采用恒溫冰凍切片機切片，片厚10μm。常規(guī)甲苯胺藍尼氏染色、SOX2免疫組化染色、Nestin免疫組化染色、BrdU免疫組化染色封

4、片。顯微鏡觀察、照相。
　　4光鏡熒光免疫組化石蠟標本和冰凍標本：熒光免疫組化石蠟標本的制備同光鏡免疫組化石蠟標本的制備；熒光免疫組化冰凍標本的制備同光鏡免疫組化冰凍的標本制備。
　　5統(tǒng)計學處理：統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0版統(tǒng)計軟件。計量資料的各項指標均采用均數(shù)±標準差(x-±s)，同一指標的組間比較采用One-WayANOVA方差分析，分析前進行方差齊性檢驗，方差齊時用LSD法，P<0.05表示有顯著性差異。

5、　　結果：
　　1甲苯胺藍染色：在腦干的橫斷切面上，最后區(qū)位于脊髓中央管背側，最后區(qū)與周圍腦組織界限明顯，染色較深，最后區(qū)呈尖向下的等腰三角形
　　2免疫組織化學染色
　　2.1 SOX2免疫組化染色：SOX2陽性細胞在最后區(qū)的腹側部呈明顯的V字形分布，與腹側的脊髓中央管相連；在背側部的軟膜下也可見密集的細胞呈帶狀分布；在最后區(qū)的中央部陽性細胞散在分布，染色較淡。
　　2.2 Nestin免疫組化染色：Nesti

6、n陽性細胞在最后區(qū)的腹側部呈明顯的V字形強陽性顯色，V字形的兩側可延伸到近軟腦膜下，V字形的中央部向腹側可延伸到脊髓中央管附近。在背側部的軟腦膜下nestin有一明顯的帶狀陰性區(qū)。在最后區(qū)的中央部呈弱陽性顯色。
　　2.3 BrdU免疫組化染色：最后區(qū)可見少量的BrdU陽性細胞表達，陽性表達細胞的細胞核呈橢圓形，其陽性細胞的細胞核較周圍大部分陰性細胞的細胞核小。
　　3免疫熒光染色
　　3.1 SOX2免疫熒光染色：最

7、后區(qū)的SOX2陽性細胞密集表達，腹側部呈V字形，中央部散在表達。
　　3.2 Nestin免疫熒光染色
　　最后區(qū)可見Nestin陽性表達細胞呈V字形分布，其免疫陽性反應物多呈細顆粒狀、少部分呈粗顆粒狀，有的顆粒散在分布，有的顆粒呈簇狀分布。有的呈長短不一的細絲狀。
　　3.3 BrdU免疫熒光染色：在最后區(qū)可見少量BrdU陽性表達細胞，有的散在分布，有的呈簇狀分布。
　　4免疫熒光雙標染色
　　4.1 S

8、OX2、BrdU熒光雙標染色：SOX2陽性細胞較密集分布，在密集的SOX2陽性細胞之間可見少量BrdU陽性細胞散在分布。
　　4.2 SOX2、Nestin熒光雙標染色：SOX2陽性細胞較密集分布，在密集的SOX2陽性細胞之間可見散在分布的Nestin陽性細胞。
　　結論：
　　1最后區(qū)SOX2陽性細胞密集表達，腹側部陽性細胞呈V字形密集分布，背側部帶狀密集分布陽性細胞，中央部陽性細胞散在分布。
　　2最后區(qū)ne