浮游態(tài)和生物被膜狀態(tài)嗜水氣單胞菌對四環(huán)素耐藥相關(guān)蛋白的研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種典型的人-獸-魚共患病病原菌，可引起動物的敗血癥和人類腹瀉，同時也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的條件致病菌，每年由該菌導(dǎo)致的魚類爆發(fā)性流行病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，引起研究人員的高度重視。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中常常使用抗生素預(yù)防與治療魚類疾病，導(dǎo)致嗜水氣單胞菌等病原菌產(chǎn)生耐藥性。此外，嗜水氣單胞菌在自然環(huán)境中易形成生物被膜，一種與浮游態(tài)相對應(yīng)的生活方式，在細(xì)菌耐藥與致病過程中發(fā)揮重要作用

2、。因此研究浮游態(tài)和生物被膜狀態(tài)下嗜水氣單胞菌抗生素耐藥相關(guān)蛋白及其功能，對治療與預(yù)防該菌具有重要的意義。
　　本試驗首先采用 TMT標(biāo)記結(jié)合 LC-MS/MS質(zhì)譜分析的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以生物被膜狀態(tài)下的嗜水氣單胞菌為研究對象，對金霉素(Chlortetracycline，CTC)應(yīng)激與遺傳獲得性耐藥兩種條件下，細(xì)菌表達(dá)差異蛋白進(jìn)行了較系統(tǒng)的比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激處理下(即Ah-CTC-O+CTC比Ah-CTC-O)共有66個

3、蛋白發(fā)生變化，其中24個蛋白下調(diào)表達(dá)，42個蛋白上調(diào)表達(dá)，而獲得性耐藥性下(即Ah-CTC-R比Ah-CTC-O)有66個蛋白下調(diào)表達(dá)，75個蛋白上調(diào)表達(dá)，共141個蛋白發(fā)生變化。細(xì)菌在應(yīng)對抗生素脅迫的應(yīng)激性耐藥，以及獲得性耐藥性之間，具有中度的相關(guān)性，提示兩者具有密切的進(jìn)化聯(lián)系。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，翻譯相關(guān)蛋白在兩者之間都顯著性上調(diào)表達(dá)，脂肪酸生物合成相關(guān)蛋白在應(yīng)激性下上調(diào)表達(dá)，其他一些代謝途徑包括丙酸代謝、不同環(huán)境中的微生物代謝和次

4、生代謝產(chǎn)物的生物合成相關(guān)蛋白在獲得性耐藥中表達(dá)下降。然后利用 q-PCR技術(shù)比較脂肪酸生物合成和丙酸代謝相關(guān)基因 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脂肪酸生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白質(zhì)表達(dá)水平基本一致，而丙酸代謝途徑的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為較大的波動，約50-60％的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平一致。最后，通過測定CTC與脂肪酸生物合成抑制劑三氯生（Triclosan，TCS）協(xié)同作用下細(xì)菌的存活率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制脂肪酸合成途徑后，細(xì)菌對抗生素顯著敏感。進(jìn)一步

5、通過Western blotting技術(shù)驗證脂肪酸生物合成途徑中的FabD蛋白在敏感菌和耐藥菌中CTC和TCS作用下的蛋白表達(dá)變化。試驗結(jié)果提示FabD等脂肪酸生物合成相關(guān)蛋白在生物被膜下的細(xì)菌耐藥過程中起著重要作用，同時提出脂肪酸生物合成抑制劑與四環(huán)素類型抗生素聯(lián)用，可以有效抑制細(xì)菌的新策略。
　　其次，采用iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析浮游態(tài)嗜水氣單胞菌在CTC應(yīng)激和獲得性耐藥性下的差異蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激處理下有1

6、16個蛋白上調(diào)表達(dá)，194個蛋白下調(diào)表達(dá)，共有310個蛋白發(fā)生變化；而獲得性耐藥性中共有252個蛋白發(fā)生變化，93個蛋白上調(diào)表達(dá)，159個蛋白下調(diào)表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)應(yīng)激性和獲得性耐藥性之間共有92個重疊蛋白，表明應(yīng)激性和獲得性耐藥性之間有相同的耐藥機制應(yīng)對抗生素脅迫。進(jìn)而對差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)核糖體亞基蛋白在二者之間都顯著性上調(diào)表達(dá)，與生物被膜結(jié)果一致。而細(xì)菌趨化性相關(guān)蛋白在獲得性耐藥性中主要是下調(diào)表達(dá)。然后利用 q-PCR技術(shù)