多組分囊泡的相分離和形變動(dòng)力學(xué).pdf

1、生物膜中主要是由脂雙層和膜蛋白構(gòu)成的,其中有些特定組成的液相微相區(qū)(如“脂筏”)關(guān)系到細(xì)胞內(nèi)能量的轉(zhuǎn)換和物質(zhì)的輸運(yùn)等重要生物物理過程。這些微區(qū)的形成被認(rèn)為是一種相分離過程。但是細(xì)胞膜中形成的這些微相區(qū)包含上百種磷脂,所以有必要采用合適的生物膜模型來簡化問題的研究。本論文基于“脂筏”這種重要功能微區(qū)的組成,在實(shí)驗(yàn)上構(gòu)建了DOPC/BSM/Cholesterol的三組分囊泡。通過熒光染色的方法,在顯微鏡下觀察到了相分離過程中微區(qū)的形成以及囊

2、泡的形變過程。結(jié)合CCD跟蹤拍攝的手段可以采集到微區(qū)在形成過程中每個(gè)階段的特點(diǎn),為詳細(xì)討論相分離動(dòng)力學(xué)行為提供了可靠的技術(shù)支持。
　　本論文就是以生物膜的相分離為背景,利用顯微鏡以及顯微操作儀等手段考察生物膜相分離中微區(qū)的形成與長大、膜伴隨相分離過程產(chǎn)生的形變以及外加離子和生物分子誘導(dǎo)膜產(chǎn)生的形變等非平衡態(tài)特點(diǎn)。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)在實(shí)驗(yàn)上利用類“脂筏”組成:DOPC/BSM/Cholesterol三組分體系進(jìn)行研

3、究,結(jié)合相圖討論了臨界點(diǎn)的相分離行為。在相變溫度以下,觀察到了兩種相分離行為:類Spinodal的雙連續(xù)相區(qū)分布和液滴狀的單連續(xù)相區(qū)分布。結(jié)合這種不同的相分離行為,討論了在相分離過程中組分比例、淬冷深度、面積限制、熒光探針以及流體力學(xué)作用等的影響。結(jié)果表明,臨界點(diǎn)對組分非常敏感,微小的波動(dòng)都可能對最后的相分離行為產(chǎn)生很大的影響。關(guān)于液滴狀微區(qū)的生長過程,進(jìn)行了詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)研究,得到了微區(qū)隨時(shí)間生長的標(biāo)度關(guān)系。與相關(guān)理論研究結(jié)果不同的是,

4、實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)度關(guān)系呈現(xiàn)一定的階段性:在微區(qū)融合初期,微區(qū)隨時(shí)間的依賴關(guān)系為:N～t-2/3;但后期則表現(xiàn)出較快的融合速率,微區(qū)數(shù)目隨時(shí)間的變化轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌闹笖?shù)關(guān)系:N～t-2。這主要是由于在后期微區(qū)的凸起造成了各個(gè)微區(qū)的流體力學(xué)效應(yīng)不再等同,我們嘗試用CIC(Collision-InducedCollisions)理論進(jìn)行了分析解釋。
　　(2)主要討論相分離后期微區(qū)長大到一定程度后形變過程中的動(dòng)力學(xué)問題。首先,微區(qū)的形變出芽不僅取

5、決于膜的彎曲剛性、界面張力以及內(nèi)外壓差,而且和囊泡的面積體積比以及膜層的厚度有很大的關(guān)系。界面張力是微區(qū)形成凸芽的推動(dòng)力,但是由于表面積受限,準(zhǔn)球形的囊泡只有在改變內(nèi)外滲透壓的情況下才能使囊泡獲得多余的表面積發(fā)生出芽。針對面積體積比較大的管形囊泡,詳細(xì)討論了出芽的動(dòng)力學(xué)過程;對于膜層較厚的囊泡,由于分相出芽過程中膜層之間存在強(qiáng)烈的偶合效應(yīng),所以出芽過程非常緩慢;在凸芽融合后期,不同相區(qū)之間達(dá)到完全的分離,但是囊泡并未由此而達(dá)到平衡態(tài)。分

6、離后的兩種相區(qū)(Lo/Ld)會繼續(xù)發(fā)生變形。一種情況是膜的破裂與重構(gòu),另外一種是在有序相區(qū)生長出很長的管形凸芽。這是由于相分離過程中,界面線張力推動(dòng)膜發(fā)生凸起導(dǎo)致膜表面應(yīng)力的增大,而膜的彎曲剛性是有一定限度的。所以當(dāng)表面應(yīng)力增到一定程度,囊泡可能通過這兩種方式釋放內(nèi)部壓力。
　　(3)詳細(xì)討論溶血磷脂酰膽堿(Lyso-PC)在相分離前后對“脂筏”組成的囊泡造成的形變動(dòng)力學(xué)問題。首先采用電形成法制備大尺度的巨型囊泡(GUV),然后利

7、用顯微操作將Lyso-PC加入到囊泡的邊緣。作為一種單鏈的磷脂,Lyso-PC和囊泡中的鞘磷脂之間會有很強(qiáng)的相互結(jié)合力。在相分離前,Lyso-PC具有引起囊泡溶解破壞的作用。在低濃度Lyso-PC作用下,囊泡呈現(xiàn)平滑收縮的過程;高濃度情況下,囊泡會產(chǎn)生劇烈的收縮,并表現(xiàn)出兩個(gè)不同階段的動(dòng)力學(xué)標(biāo)度關(guān)系。結(jié)合囊泡收縮動(dòng)力學(xué)理論,簡單討論了囊泡在收縮過程中包含的兩個(gè)階段:(1)孔的成核;(2)孔的形成和閉合。通過實(shí)驗(yàn)得到了囊泡收縮過程中的動(dòng)力

8、學(xué)標(biāo)度關(guān)系:R～t-0.25,R～t-1和理論的分析修正值相吻合;當(dāng)發(fā)生相分離后,通過顯微鏡可以觀察到囊泡表面形成了BSM/Chol富集的類“脂筏”微區(qū)。作為液相有序區(qū)(Lo),這種結(jié)構(gòu)致密的微區(qū)可以抵抗Lyso-PC的抽提破壞。而且,它可以誘導(dǎo)微區(qū)發(fā)生變形,甚至出芽。利用ADE(Area-DifferenceElasticity)理論模型解釋這個(gè)過程的發(fā)生主要是分子釘扎誘導(dǎo)了脂雙層的側(cè)向壓力增大,造成了微區(qū)的凸起變形。
　　(4

9、)由于鈣離子的影響,含膽固醇的磷脂體系會在相變溫度以下產(chǎn)生具有動(dòng)態(tài)特征的多邊形微區(qū)圖樣。這種體系適用于具有不同長度疏水鏈的帶電磷脂和中性磷脂。在相變溫度以下,膽固醇可以和磷脂分子中的羰基以氫鍵形成復(fù)合物造成脂肪?；湹淖杂蛇\(yùn)動(dòng)減少,引起膜的壓縮。所以,膽固醇的存在通過對磷脂堆垛的壓縮效應(yīng)促使膜內(nèi)每個(gè)磷脂所占據(jù)的單位面積減小,從而對鈣離子的濃度更為敏感。在低溫下,鈣離子有可能與磷酸根發(fā)生絡(luò)合形成網(wǎng)絡(luò)狀的結(jié)構(gòu),這種絡(luò)合可能促進(jìn)磷脂相態(tài)由層狀

10、相轉(zhuǎn)變?yōu)榱窍鄰亩谀遗荼砻娉尸F(xiàn)出規(guī)則的六角形排列。微區(qū)圖樣的形狀的演化取決于鈣離子和磷酸根之間的靜電作用力與相邊界線張力的大小。如果在相分離后期繼續(xù)添加鈣離子,微區(qū)將繼續(xù)保持多邊形的圖樣。這也進(jìn)一步說明了這種多邊形圖樣主要是由于靜電力的大小決定的。除了鈣離子,我們還采用了Na+,Al3+進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩種離子同樣可以誘導(dǎo)磷脂/膽固醇發(fā)生這種特殊結(jié)構(gòu)的微區(qū)。如果把溫度回升到相變溫度以上時(shí),可以觀察到微區(qū)消失,囊泡恢復(fù)到降溫