濕地松、火炬松離體培養(yǎng)植株再生技術的研究.pdf

1、濕地松、火炬松自上世紀30年代引種至今，兩樹種已成為我國南方地區(qū)大面積造林的主要經濟樹種。然而，其相對滯后的良種繁育技術仍然制約著兩個樹種的發(fā)展。本研究以濕地松、火炬松不同組織器官為材料，對其直接器官發(fā)生、間接器官發(fā)生、直接體胚發(fā)生等離體培養(yǎng)快繁技術進行系統研究，以建立高效、穩(wěn)定的濕地松、火炬松離體培養(yǎng)植株再生體系，為其它針葉樹種的組培快繁技術提供借鑒。研究的主要內容及結果以下： 一．濕地松直接器官發(fā)生與植株再生技術 以

2、濕地松抗病家系和非抗病家系的成熟合子胚為外植體，以不同基本培養(yǎng)基、激素種類及濃度配比和不同的培養(yǎng)方式，研究濕地松離體培養(yǎng)繼代增殖的關鍵技術及主要影響因子。研究結果表明濕地松家系或基因型、繼代代數及激素種類濃度的配比是濕地松組培繼代增殖效率的主要影響因子。濕地松組培快繁的最佳增殖培養(yǎng)基為B5+6-BA2.0mg／L+IBA0.1mg/L，年增殖率可達3.696.2。利用家系間或家系內個體間增殖率的顯著差異，篩選了適宜組培快繁的普通家系優(yōu)良

3、基因型132個、抗病家系優(yōu)良基因型2個。通過固體培養(yǎng)與添加液體營養(yǎng)液的雙層培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式解決了濕地松繼代增殖率與有效芽苗率的消長問題，有效縮短了繼代周期，簡化了培養(yǎng)程序。 生根培養(yǎng)階段，通過對培養(yǎng)基大量元素濃度水平的對比試驗，結果表明生根培養(yǎng)初期以無大量元素培養(yǎng)基誘導生根，25d后添加大量元素的培養(yǎng)程序可有效縮短生根培養(yǎng)時間，提高生根率，達到理想的生根效果。 本研究基本解決了濕地松長期繼代增殖及生根技術問題，建立了穩(wěn)定

4、的離體快繁增殖及生根體系。但該培養(yǎng)技術的產業(yè)化應用還需進一步的中試及相關操作工藝設備的改進，以降低組培苗的生產成本。 二、濕地松間接器官發(fā)生與植株再生技術 以濕地松成熟合子胚、胚苗頂芽、下胚軸、胚根為外植體，選用低鹽量的DCR、LP、TX 3種基本培養(yǎng)基，與不同濃度N從、2，4-D及不同濃度6-BA組合，研究濕地松器官性愈傷組織誘導、增殖及器官分化培養(yǎng)階段的關鍵技術。試驗結果表明：成熟合子胚、胚苗頂芽是誘導器官性愈傷組織

5、理想的外植體，誘導器官性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為TX+BA 0.5 mg／L+NAA 2.0 mg/L+30 g／L蔗糖，誘導率高達50％以上；增殖培養(yǎng)基為Tx+BA 0.3 mg／L+NAA 1.0 mg／L+CH 400mg／L+30 g／L蔗糖，繼代周期25～30d，增殖率達3.46；器官分化培養(yǎng)基為TX+BA0.5 mg／L+IBA 0.5 mg／L+30 g／L蔗糖，每塊愈傷組織可分化20個以上不定芽；不定芽的同步化發(fā)育培養(yǎng)基為

6、TX+BA 0～0.2 mg／L+IBA 0.5 mg/L+30 g／L蔗糖；NAA是器官性愈傷組織誘導、增殖必不可少的生長素。濕地松間接器官發(fā)生程序復雜，但其增殖效率遠遠高于直接器官發(fā)生效率。組織細胞學研究結果表明：亮白色、半緊實結構的外部形態(tài)及大量“擬分生組織”的內部結構的形成是器官性愈傷組織的重要標志。不定芽原基的分化發(fā)育過程約為40～45d。 三、濕地松體細胞胚胎發(fā)生 以濕地松成熟合子胚及未成熟合子胚為外植體，對

7、影響濕地松體胚誘導、ESM維持與增殖培養(yǎng)及體胚成熟等關鍵技術環(huán)節(jié)的主要因素進行系統研究。研究結果表明：多胚特征的合子胚發(fā)育階段是濕地松體胚誘導最理想的外植體，即發(fā)育第2、3、4階段的合子胚?；九囵B(yǎng)基、激素種類濃度組合及兩因素的交互作用對ESM誘導率及外植體褐化率均有極顯著影響，濕地松體胚發(fā)生最佳培養(yǎng)基激素組合為LP+2，4-D 2.2 mg／L+6-BA 1.0mg／L和DCR+NAA2.0 mg／L+6-BA0.63mg／L+KT0

8、.61mg／L，4個家系在兩種培養(yǎng)基ESM平均誘導率分別為24％和22.75％。球果短時間冷藏處理、雌配子體“傾斜接種"方式以及在培養(yǎng)基添加乙烯抑制劑及pH緩沖液均有利于提高濕地松體胚誘導率，采用國產瓊脂代替進口Phytagel作為植物凝膠劑可起到同樣的誘導效果。 ESM維持培養(yǎng)階段，胚性組織胚性的失去或因生長勢的衰弱而死亡是針葉樹種體胚發(fā)生的普遍現象。通過對培養(yǎng)基與激素組合的優(yōu)化獲得了4個可長期快速增殖的胚性細胞系，DCR+N

9、AA 1.0 mg／L+6-BA 0.32 mg／L+KT 0.30 mg／L為濕地松ESM的最佳增殖培養(yǎng)基。生長素是維持胚性的極性結構所必需的，但高濃度的生長素對體胚的生長、發(fā)育成熟不利，尤其是高濃度2，4-D可能導致體胚的畸形。 添加AC的無激素預培養(yǎng)是體胚發(fā)育成熟的必要條件。ABA是體胚從增殖到成熟轉化的關鍵因素。外源ABA與PEG和高濃度蔗糖的組合進一步促進了體胚的發(fā)育成熟，濕地松體胚在成熟培養(yǎng)基PL+ABA 50 mg

10、／L+PEG6000 20％+6％蔗糖上獲得了發(fā)育5階段的子葉胚。 四、火炬松體細胞胚胎發(fā)生 以火炬松優(yōu)良家系20—692、20—615、20—1036、20—639不同球果采收期合子胚為外植體，選用4種針葉樹體胚發(fā)生專利培養(yǎng)基AL、TX、LP、DS分別與AL、TX、LP培養(yǎng)基激素組合及無激素組合形成16種體胚誘導培養(yǎng)基，開展火炬松體胚誘導試驗。研究結果表明：體胚誘導最理想的外植體為第2、3、4發(fā)育階段合子胚。外植體基因

11、型是影響體胚誘導率的關鍵因素，通過培養(yǎng)基、激素組合及其它培養(yǎng)條件的優(yōu)化是打破離體培養(yǎng)頑拗型基因型限制的有效措施。LP+2，4一D2.2 mg／L+6-BA 1.0mg／L、AL+2，4-D 2.2 mg／L+6-BA 1.0mg／L培養(yǎng)基可獲得較高的體胚誘導率，且體胚質量高。 不同的胚性細胞系對體胚成熟培養(yǎng)反應不同，只有具有完整體胚的培養(yǎng)物轉入成熟培養(yǎng)基，體胚才能進一步的發(fā)育成熟?；鹁嫠膳咝约毎礎L-225經無激素培養(yǎng)基預培養(yǎng)