部分蜘蛛牽絲Ⅰ型蛋白基因合成及其聚合體的表達(dá)研究.pdf

1、蜘蛛牽絲是構(gòu)成蜘蛛網(wǎng)的框架絲,是目前已知強(qiáng)度最高的天然蛋白質(zhì)絲,能夠與市售制造防彈衣的人工合成纖維相媲美.它由牽絲Ⅰ型和牽絲Ⅱ型蛋白按3:2的比例構(gòu)成,這兩種蛋白質(zhì)絲在結(jié)構(gòu)上存在許多相似之處,其N端均為串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu),包括由多聚丙氨酸構(gòu)成的β折疊結(jié)構(gòu)和由其它氨基酸構(gòu)成的α螺旋與β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),C端含有約100多個氨基酸組成的非重復(fù)區(qū).各串聯(lián)重復(fù)區(qū)之間以及其與非重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)間無其它散在元件.研究表明牽絲的強(qiáng)度主要取決于β折疊結(jié)構(gòu),而彈性則主要來源

2、于α螺旋和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu).現(xiàn)推測牽絲Ⅰ型蛋白較牽絲Ⅱ型蛋白具有更高強(qiáng)度.該工作以1990年Xu等人報道的金紡者牽絲Ⅰ型蛋白基因序列為基礎(chǔ),通過RNA二級結(jié)構(gòu)分析確立使其結(jié)構(gòu)能級達(dá)到較低的密碼子,分別合成含有三組多聚丙氨酸的牽絲Ⅰ型蛋白部分重復(fù)區(qū)序列(單體)及其3'端非重復(fù)區(qū)多肽基因,并在第三組多聚丙氨酸結(jié)構(gòu)中增加或減少一個丙氨酸,得到三種不同的單體基因.再經(jīng)過酶切、連接分別獲得重復(fù)區(qū)為2、4、8、16拷貝的聚合體,并將它們與3'端非重復(fù)區(qū)基

3、因連接獲得15種牽絲Ⅰ型蛋白基因類似物.序列比對顯示;合成基因八聚體與報道基因所編碼氨基酸同源性高達(dá)84﹪,二者具有類似mRNA二級結(jié)構(gòu).另根據(jù)重復(fù)區(qū)基因編碼的多肽序列合成含有α螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的半抗原短肽(17AA),通過MBS與抗原KLH連接,連接產(chǎn)物經(jīng)乳化后免疫成年在雄性新西蘭大耳白兔和20g以上雄性Bab/c小鼠,每兩周免疫一次,共免疫5次,得到效價為64×10<'4>的兔抗血清及效價為1.0×10<'4>的鼠抗血清,用于檢測

4、合成基因的表達(dá).將上述不含非重復(fù)區(qū)序列的2、4、8聚合體分別克隆大腸桿菌表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)菌體總蛋白的SDS-PAGA電泳檢測未見明顯特異表達(dá)帶,Western-blot顯示無特異帶.但采用利福平阻斷菌體基因表達(dá),并在培養(yǎng)基中添加<'35>S-Met,通過放射自顯影可見由T7啟動子起始的特異目的基因表達(dá)帶.將含有非重復(fù)區(qū)序列的三種二聚體和三種四聚體克隆真核表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、293T(SV40大T