重組蜘蛛包裹絲蛋白AcSp1的表達純化、成絲機理及性能研究.pdf

1、早在蜘蛛絲進入研究領(lǐng)域之前，人類已經(jīng)開始利用蜘蛛絲了。在古希臘，人們利用天然蜘蛛絲縫合傷口;后來蛛絲用在軍事上，可以用來做十字準線?，F(xiàn)代隨著對蜘蛛絲的關(guān)注和研究發(fā)現(xiàn)，蜘蛛絲在生物醫(yī)學上有十分優(yōu)良的應(yīng)用前景，包括可以作為組織工程支架，藥物運輸載體和神經(jīng)導管等。蜘蛛絲的諸多用途要歸功于它的化學穩(wěn)定性、生物相容性、絲質(zhì)光滑且細的特點。不僅如此，它還具有很高的強度、彈性、柔韌性、延展性和抗斷性以及輕盈、生物可降解等優(yōu)點。蜘蛛絲所表現(xiàn)出來的優(yōu)良性

2、能是包括蠶絲在內(nèi)的天然纖維和合成纖維所無法比擬的。
　　但是，目前為止對蛋白質(zhì)絲應(yīng)用得最多的是性能不如蛛絲的蠶絲，而對蛛絲的大規(guī)模生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用仍處于空白，主要有以下幾個原因:(1)蜘蛛是肉食性動物，不易馴化，不能像蠶一樣高密度飼養(yǎng)。此外，一個蠶繭產(chǎn)600至900米的纖維絲蛋白，而蜘蛛的囊狀腺只能產(chǎn)生137米的絲，并且一個完整的蜘蛛網(wǎng)中的絲只有12米。(2)天然蜘蛛絲的組分，成絲機理和紡絲過程極其復(fù)雜。由于使用天然蛛絲回溶后紡絲這

3、一過程會影響蛛絲的性能，因此無法紡出性能接近天然蛛絲的絲纖維，這對蜘蛛絲的應(yīng)用來說是更是雪上加霜。(3)采用基因工程的方法在異源宿主中表達生產(chǎn)重組蛛絲蛋白是目前為止最有潛力的方法。但是這同樣面臨著困難，因為大部分蜘蛛絲蛋白的中央是高度重復(fù)的序列，其分子量可以達到300kDa以上，并且重復(fù)區(qū)富含甘氨酸和丙氨酸。在用異源宿主表達蜘蛛絲蛋白的時候不僅面臨著密碼子使用偏好性問題，這種序列特點同時帶來了tRNA庫需要共進化，同時這種高GC含量的D

4、NA造成特殊二級結(jié)構(gòu)，并導致基因重組。因此生產(chǎn)出來的蜘蛛絲蛋白達不到天然蜘蛛絲蛋白的大小，產(chǎn)量低，性能遠不及天然蛛絲蛋白。
　　目前，國內(nèi)外對蜘蛛絲的研究主要集中在以下幾個方面:(1)天然蛛絲蛋白基因序列的獲得和測定;(2)選擇合適的宿主細胞表達分子量盡可能大且產(chǎn)量高的蛛絲蛋白，即人工生產(chǎn)蜘蛛絲方法的研究;(3)天然蛛絲成絲過程的研究(4)蜘蛛絲蛋白的內(nèi)在結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系，及成絲機理的研究;(5)改進蛛絲性能的研究。
　　圓

5、網(wǎng)蜘蛛可以生產(chǎn)至少六種絲和一種粘性蛋白，這些絲可以用于織網(wǎng)，包裹獵物和結(jié)繭等。在眾多種類的蜘蛛絲中，大壺腹腺(Major Ampullate，MA)絲形成拖絲，是所有蜘蛛絲中最強的絲也是研究得最多的。它的抗張強度可以和Kevlar媲美(4×109N/m2)，而它的彈性比Kevlar高7倍（拖絲35％，Kevlar5％）。蜘蛛的捕捉絲是粘絲，由鞭毛狀腺和聚合腺生產(chǎn)，它很有彈性，而且可以伸長到原來的三倍而不斷裂。蜘蛛包裹絲由葡萄狀腺生產(chǎn)，因

6、此也可以叫做葡萄狀腺絲，用來包裹獵物，還可以用來建卵袋的內(nèi)層結(jié)構(gòu)。它在所有蛛絲中韌性最強，因為它綜合了高強度和高彈性，在有外力強加到它時它可以吸收能量，不至于斷裂。研究顯示，來自Argiope trifasciata的包裹絲甚至比拖絲的韌性強50％。本論文中首次研究了異源表達Argiope trifasciata重組包裹絲蛋白，填補了除拖絲之外另一大類蛛絲蛋白的研究空白。
　　采用基因工程的方法生產(chǎn)蜘蛛絲的第一步就是獲得編碼蛛絲蛋

7、白的DNA序列。在本論文中根據(jù)已知的來自Argiope trifasciata的包裹絲蛋白(AcSp1)重復(fù)單元DNA序列，優(yōu)化了密碼子使其適應(yīng)于在大腸桿菌中表達，然后用化學合成的手段，獲得包裹絲中央?yún)^(qū)單個重復(fù)單元的DNA片段。在該序列兩端設(shè)計有合適的“無縫”限制性內(nèi)切酶識別和切割位點，將這段序列連入合適的質(zhì)粒載體，然后通過DNA酶切和連接的方法將單個重復(fù)單元首尾相連構(gòu)建成含有兩個重復(fù)單元的序列。用這樣的方法繼續(xù)拼接可以得到含有多個重復(fù)

8、單元的DNA序列。同時將含有重復(fù)序列的蛛絲蛋白與融合蛋白(SUMO)融合表達可以提高蛋白可溶性和產(chǎn)量。采用這種方法在大腸桿菌中表達的蛛絲蛋白產(chǎn)量可以達到22-80mg/L。
　　在選擇異源宿主細胞生產(chǎn)蛛絲蛋白方面，人們嘗試過使用酵母、昆蟲細胞、牛的乳腺上皮細胞、倉鼠幼崽的腎臟細胞、植物、動物和蠶。但是目前使用最多的還是在大腸桿菌中表達蛛絲蛋白。該表達系統(tǒng)可控性強，生產(chǎn)簡單，成本低。但是由于原核和真核表達系統(tǒng)的差異性，使得原核表達的

9、蛛絲蛋白大小遠不及天然蛛絲蛋白。目前為止只有一個通過成功改造大腸桿菌基因組而表達出大小接近天然蛛絲大小的例子，但是該系統(tǒng)表達產(chǎn)量低，純化效果不佳。因此，采用其他手段獲得長度接近天然蛛絲大小的研究具有非常重要的意義。本論文中研究了分段表達蛛絲蛋白并成功改造了split-intein（斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子），有希望將蛛絲蛋白片段在體外通過intein的自我剪接反應(yīng)連接起來，從而獲得大小接近天然蛛絲蛋白的重組蛛絲蛋白。
　　在成絲機理方面

10、，目前有兩種模型解釋蛛絲形成:一種說法認為，蛛絲蛋白由于疏水作用先形成小球，這些小球聚集起來在拉力/剪切力的作用下形成含有β-折疊結(jié)構(gòu)的絲纖維;另一種說法認為，絲蛋白分子先整齊排列形成小棒狀結(jié)構(gòu)的多聚體—液晶態(tài)結(jié)構(gòu)，再在外力的作用下形成β-折疊結(jié)構(gòu)。關(guān)于蛛絲蛋白在蜘蛛腺體內(nèi)的生產(chǎn)和蜘蛛拉絲的研究結(jié)果僅限于對大壺腹腺蛋白，而對其他絲腺蛋白的研究仍處于空白。另外，研究發(fā)現(xiàn)在蜘蛛拖絲形成過程中伴隨著化學環(huán)境的變化，其中包括鈉離子和氯離子濃度的

11、降低，鉀離子、磷酸離子和氫離子濃度的升高。這些化學環(huán)境的變化及成絲模型是否適用于其他類型的蛛絲形成過程目前還是未知數(shù)。在本論文中采用了掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、圓二色光譜、拉曼光譜，核磁共振和納米拉力測試儀等手段，研究了重組包裹絲蛋白體外成絲過程，包括其溶液中和成絲后的分子結(jié)構(gòu)，分子聚集形態(tài)，發(fā)現(xiàn)了該蛋白自動成絲所需的最小重復(fù)單元數(shù)目，并測得了含有四個重復(fù)單元的包裹絲的強度平均為115MPa，比之前報道的可以自動成絲

12、的拖絲蛋白略強，是天然包裹絲強度的1/6左右。溶液中和成絲過程中該重組包裹絲蛋白可以聚集成小球結(jié)構(gòu)，小球結(jié)構(gòu)在剪切力的作用下可以排列形成微絲結(jié)構(gòu)，微絲再聚集并脫水形成成熟的絲結(jié)構(gòu)，這驗證和支持了小球理論。同時，在這一由液相到固相的轉(zhuǎn)變過程中伴隨著蛋白二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中富含α-螺旋而成熟的絲中富含β-折疊結(jié)構(gòu)，與天然包裹絲的結(jié)構(gòu)十分相似。
　　大部分蛛絲蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成上包含一個大的中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域，和N-端及C-

13、端非重復(fù)結(jié)構(gòu)域。C-端非重復(fù)結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上相對于中央重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)域保守，所以人們推測它具有一定的功能。通過對重組拖絲蛋白的C-端非重復(fù)結(jié)構(gòu)域的研究發(fā)現(xiàn)它可以幫助中央重復(fù)區(qū)形成排列具有一定方向性的絲。在對重組包裹絲AcSp1的研究后我們發(fā)現(xiàn)C-端非重復(fù)結(jié)構(gòu)域不僅可以幫助蛛絲蛋白成絲，而且可以改善絲的力學性能，但是對所成的絲的表面結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。
　　本研究為幫助理解蛛絲蛋白形成過程、成絲機理及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系作出了一定貢獻