新型分子信標的合成及其性能研究.pdf

1、上世紀80年代，基于經(jīng)典的固相合成技術演化而來的DNA 自動合成儀的誕生，突破了DNA 化學合成的瓶頸，使得人們可以相當自由地設計各種類型的核酸分子探針，廣泛地應用于生物學、醫(yī)學等領域。但在后基因組學和蛋白質(zhì)組學時代，人們不斷對核酸分子探針在靈敏度、穩(wěn)定性、分子識別與信號轉(zhuǎn)換方式等多方面提出更高的要求，以發(fā)展新的分子生物學研究方法，這使得核酸分子探針的設計合成顯得更為重要。本論文通過搭建核酸合成平臺，開展了新型分子信標核酸分子探針的合成

2、與性能研究，主要包括了以下三個方面的工作：
　　 (1)核酸合成平臺的搭建基于DNA 合成儀和液相色譜技術，合成純化了普通DNA 引物(cDNA)、常規(guī)分子信標(DNA-MB)以及超淬滅分子信標(SQ-MB)，利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對純化產(chǎn)物進行了分析，結果表明所得到的純化產(chǎn)物均為目標分子。與cDNA 雜交的結果表明，超淬滅分子信標的信背比達到40 倍，比常規(guī)分子信標高出4 倍。說明我們已經(jīng)

3、掌握了普通DNA 引物以及染料標記的DNA 探針的合成與純化技術。
　　 (2)鎖核酸分子信標的合成與性能考察為了實現(xiàn)活細胞內(nèi)mRNA的監(jiān)測，需要雜交速度快、靈敏度高、抗酶切能力強、選擇性好的核酸分子探針。我們合成了一種莖部具有三對配對堿基的鎖核酸分子信標(LNA-MB)，其與cDNA 雜交反應速度快，5分鐘即可達到平衡。
　　 與常規(guī)分子信標相比，該鎖核酸分子信標抗酶切能力顯著增強，熱穩(wěn)定性有了明顯提高。
　　

4、 (3)鎖核酸分子信標與共臂cDNA 雜交性能的考察有研究工作表明分子信標與共臂cDNA (s hared-stem cDNA)雜交能夠提高其靈敏度。因此我們考察了鎖核酸分子信標與共臂cDNA的雜交性能。結果表明：與cDNA 相比，共臂cDNA與鎖核酸分子信標雜交的靈敏度更高，信背比達到200 倍，線性范圍為20 pmol·L-1-20 nmol·L-1，檢測限為9.8 pmol·L-1，且具有較好的選擇性，雜交反應前20 s 內(nèi)的熒光