補腎調(diào)沖方對多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　體外培養(yǎng)人多囊卵巢綜合征子宮內(nèi)膜細(xì)胞，研究補腎調(diào)沖方對多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.人子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)：通過診刮獲取多囊卵巢綜合征患者的子宮內(nèi)膜組織，采用膠原酶消化法，體外混合培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
　　2.細(xì)胞鑒定：經(jīng)免疫熒光法鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞特異性表面蛋白，以證實所獲得細(xì)胞為子宮內(nèi)膜細(xì)胞，可進(jìn)行后續(xù)研究；
　　3. MTT實驗：應(yīng)

2、用 MTT比色法檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外生長曲線，從而確定實施藥物干預(yù)的時間點；檢測補腎調(diào)沖方、孕酮、17β-雌二醇對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長抑制率，參考細(xì)胞生長抑制率IR≤10％所對應(yīng)藥物濃度加藥干預(yù)；將子宮內(nèi)膜細(xì)胞分為實驗組、陽性對照組、陰性對照組、空白對照組，其中實驗組、陽性對照組、陰性對照組分別予以補腎調(diào)沖方、孕酮及17β-雌二醇干預(yù)，空白對照組無干預(yù)措施；
　　4.透射電鏡觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：藥物干預(yù)后，分別收集各組子宮內(nèi)膜

3、細(xì)胞，對其進(jìn)行固定、切片，在透射電鏡下觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；
　　5. ELISA法檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞中孕激素受體的表達(dá)：藥物干預(yù)后，分別收集各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞，通過反復(fù)凍融使其釋放孕激素受體，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法測定各組細(xì)胞中孕激素受體水平；
　　6.RT-PCR及Western blot檢測TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白的表達(dá)：藥物干預(yù)后，分別收集各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞，采用半定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞中TGF

4、-β1、Smad4 mRNA的表達(dá)；通過Western blot法檢測各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.體外成功培養(yǎng)出原代人子宮內(nèi)膜細(xì)胞并對其進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
　　2.經(jīng)免疫熒光法鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞特異性表面蛋白 Vimentin表達(dá)陽性，腺上皮細(xì)胞特異性表面蛋白 CK-19表達(dá)陽性；
　　3.子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)第3天進(jìn)入對數(shù)生長期，并持續(xù)至第5天，第6天進(jìn)入平臺期，因此本實驗

5、選擇體外培養(yǎng)第3天對子宮內(nèi)膜細(xì)胞實施藥物干預(yù)；對子宮內(nèi)膜細(xì)胞實施藥物干預(yù)的濃度分別為：補腎調(diào)沖方2mg/mL，孕酮1×10-6M，17β-雌二醇5×10-7M；
　　4.經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與雌激素組、空白對照組相比，實驗組、孕激素組細(xì)胞表面微絨毛數(shù)量多，有分支，甚至腫脹，線粒體體積增大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，高爾基體腫脹；
　　5. ELISA法檢測子宮內(nèi)膜細(xì)胞中孕激素受體水平發(fā)現(xiàn)，實驗組子宮內(nèi)膜細(xì)胞中孕激素受體濃度低于空白對照

6、組、雌激素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；實驗組孕激素受體表達(dá)與孕激素組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　6.經(jīng)半定量RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)高于雌激素組、空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；實驗組TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)與孕激素組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　本課題以陰