基于質(zhì)譜技術(shù)的甘油磷脂和甘油三酯高效分析方法及其應(yīng)用研究.pdf

1、甘油磷脂是機(jī)體內(nèi)含量最多的一類磷脂，它除了構(gòu)成生物膜外，還是膽汁和膜表面活性物質(zhì)等的成分之一，參與細(xì)胞膜對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)，與許多代謝類疾病相關(guān)，如心血管病、高血壓、糖尿病、肥胖病、神經(jīng)性疾病、脂肪肝、冠心病和癌癥等。甘油磷脂的基本結(jié)構(gòu)是磷脂酸和與磷酸相連的取代基團(tuán)，可以根據(jù)取代基團(tuán)的不同又可以分為許多類別，其中較為重要的有:磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸和磷脂酰甘油等。通過了解甘油磷脂在生物體內(nèi)的代謝

2、情況，以及在不同生理和病理狀態(tài)下甘油磷脂組成和結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而可全面了解甘油磷脂在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮的重要作用。但甘油磷脂種類繁多，含量極低，且結(jié)構(gòu)中缺少易電離的官能團(tuán)，導(dǎo)致對(duì)甘油磷脂的鑒定和定量分析比較困難。利用化學(xué)衍生化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可以改善其色譜行為、顯著提高質(zhì)譜(MS)檢測的靈敏度。MS與衍生化方法結(jié)合已被廣泛用于在蛋白質(zhì)，糖類及代謝物和許多其它的代謝物分析中。近年來，這一策略在脂質(zhì)分析研究中引起了極大的興趣。

3、　　本課題以氨基磷脂為研究對(duì)象，結(jié)合化學(xué)衍生化技術(shù)、高效液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種基于化學(xué)衍生化技術(shù)的氨基磷脂高選擇性、高靈敏定性和定量分析方法研究，以突破現(xiàn)有技術(shù)在氨基磷脂分析檢測中的技術(shù)瓶頸。本論文研究結(jié)果如下:
　　1.本文建立了一種基于丙酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合HPLC-MS技術(shù)的氨基磷脂定性和絕對(duì)定量分析方法。與未發(fā)生衍生化反應(yīng)的氨基磷脂相比，還原烷基化反應(yīng)后的磷脂酰乙醇胺(PE)和

4、磷脂酰絲氨酸(PS)的靈敏度分別提高了8.13和15.71倍，且色譜柱的柱效也分別提高了4.41和10.18倍。此外，我們通過選擇2種或3種d0-丙酮標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)建立校準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)d6-丙酮標(biāo)記的肝臟中的氨基磷脂的絕對(duì)定量分析，解決了氨基磷脂分析中的內(nèi)標(biāo)物缺乏和不同氨基磷脂的鏈長、不飽和度、濃度、溶劑組成以及儀器信號(hào)波動(dòng)等因素造成的質(zhì)譜響應(yīng)的差別導(dǎo)致的定量難的瓶頸問題。最后，將上述建立的方法應(yīng)用于高脂膳食喂養(yǎng)、含多酚高脂膳食喂養(yǎng)

5、的大鼠肝臟中氨基磷脂的定性和定量分析，結(jié)合Lipid Maps和Lipid View數(shù)據(jù)庫，在大鼠肝臟中共鑒定出48種PE和22種PS分子，應(yīng)用多變量分析成功的找出了差異顯著的PE和PS分子種類。相比高脂對(duì)照組，共有17種PE和PS的含量顯著性增加;3種PE和PS的含量顯著性降低。
　　2.建立了基于直接進(jìn)樣技術(shù)(shotgun-ESI-MS)的甘油磷脂(PLs)和甘油三酯(TAG)的分析方法。對(duì)不同的飲食喂養(yǎng)(基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(Z;

6、n=6)、高脂飼料喂養(yǎng)(C;n=6)、每千克高脂飼料添加200mg葡萄多酚喂養(yǎng)(S;n=6)、每千克高脂飼料添加200mg油菜多酚喂養(yǎng)(R;n=6）以及每千克高脂飼料添加混合的200mg葡萄多酚和200mg油菜多酚喂養(yǎng)(F;n=6））的大鼠肝臟樣本中PLs和TAG分子種類進(jìn)行了定性和定量分析。結(jié)合Lipid Maps和Lipid View數(shù)據(jù)庫，在大鼠肝臟中的77種TAG、55種PC、49種PE、22種PS、13種PI和13種PG分子，