內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜細(xì)胞保護(hù)作用及PAF受體拮抗劑干預(yù)的研究.pdf

1、近年研究發(fā)現(xiàn)肽類物質(zhì)在胃粘膜損傷的保護(hù)和修復(fù)方面發(fā)揮重要作用。胃黏膜上皮的生長(zhǎng)、更新和修復(fù)的過(guò)程是受到嚴(yán)格調(diào)控的，這一調(diào)控機(jī)制主要來(lái)自黏膜本身，有多種肽類物質(zhì)參與，其修復(fù)能力可能與這些肽類物質(zhì)的表達(dá)水平有關(guān)。在兒科危重癥中，重癥感染是急性胃黏膜損傷的常見原因。在重癥感染內(nèi)毒素血癥時(shí)肽類物質(zhì)如何發(fā)揮對(duì)胃粘膜損傷的保護(hù)和修復(fù)作用目前尚不清楚，是否是通過(guò)傳統(tǒng)的前列腺素途徑發(fā)揮作用，尚缺少研究報(bào)道。 乳癌相關(guān)肽(pS2)即三葉因子1(T

2、FF1)為三葉肽家族一成員，其結(jié)構(gòu)是6個(gè)半胱氨酸殘基形成3個(gè)鏈內(nèi)二硫橋。pS2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖而使胃黏膜具有防御和修復(fù)功能，其對(duì)不同細(xì)胞系具有促有絲分裂作用。pS2在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中的表達(dá)變化及對(duì)胃粘膜的保護(hù)和修復(fù)作用機(jī)制尚不清楚。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-alpha(TGF-α)是表皮生長(zhǎng)因子家族中一類胃黏膜損傷后修復(fù)的主要調(diào)節(jié)肽，能促進(jìn)胃黏膜上皮的代謝和生長(zhǎng)。由于胃黏膜本身合成TGF-α，所以TGF-α是維持胃黏膜完整性最重

3、要的肽類物質(zhì)。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中TGF-α表達(dá)變化及pS2基因、TGF-α基因表達(dá)的時(shí)相關(guān)系尚需研究。 環(huán)氧合酶-2(COX-2)為COX同工酶的誘導(dǎo)型，是前列腺素(PGs)合成過(guò)程中一個(gè)重要的限速酶。前列腺素是一種脂質(zhì)，主要在精囊、腎髓質(zhì)、肺和胃腸道中合成。PG的不斷產(chǎn)生和釋放對(duì)胃黏膜細(xì)胞起保護(hù)作用，促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞愈合。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中COX-2表達(dá)變化及調(diào)控、前列腺素E2(Prostaglandin E

4、2，PGE2)濃度變化尚不十分清楚。 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是NOS同工酶的誘導(dǎo)型，內(nèi)源性一氧化氮(NO)的產(chǎn)量有賴于細(xì)胞iNOS的表達(dá)量。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中iNOS表達(dá)變化及調(diào)控、NO含量變化及對(duì)胃粘膜的作用尚不十分清楚。 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種分子量為35712u(36000道爾頓)核蛋白，是細(xì)胞DNA合成不可缺少的因子，存在于細(xì)胞核內(nèi)不同部位，PC-NA的出現(xiàn)與細(xì)胞增殖周期密切相關(guān)，是反

5、映細(xì)胞增殖活性的重要生物學(xué)指標(biāo)。PCNA在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中的變化尚未見報(bào)道。 血小板活化因子(PAF)是迄今發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性潰瘍形成介子中最強(qiáng)的一個(gè)，對(duì)其它炎性細(xì)胞因子的作用起增強(qiáng)作用。PAF受體拮抗劑能顯著改變內(nèi)毒素或PAF引起的血流動(dòng)力學(xué)變化及組織器官的損傷。 本研究的目的是通過(guò)觀察幼年大鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和PGE2、NO的變化，胃黏膜COX-2、iNOS、pS2、TGF-α蛋白及mR

6、NA和PCNA蛋白表達(dá)變化，以及PAF受體拮抗劑對(duì)其影響，從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平、蛋白質(zhì)水平及分子水平探討內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜細(xì)胞保護(hù)作用及PAF受體拮抗劑對(duì)其影響，研究胃粘膜損傷保護(hù)和修復(fù)調(diào)控的分子機(jī)制，為胃粘膜損傷的預(yù)防和治療開辟新的途徑，也為三葉肽制劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 材料和方法: 1.材料: 用腹腔注射內(nèi)毒素(5 mg/kg O55：B5脂多糖)方法制備18日齡Wistar大鼠內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型，

7、腹腔注射同等量生理鹽水為對(duì)照組，腹腔注射內(nèi)毒素前0.5 h腹腔注射PAF受體拮抗劑(5 mg/kg BN52021 GinkgolideB)為預(yù)防組，腹腔注射內(nèi)毒素后0.5 h腹腔注射PAF受體拮抗劑(5 mg/kgBN52021 GinkgolideB)為治療組。分別于內(nèi)毒素腹腔注射后1.5，3，6，24，48，72 h斷頭處死動(dòng)物，大體觀察胃黏膜損傷情況，記錄潰瘍指數(shù)(UI)；在腺胃區(qū)胃大彎處取0.5cm×0.5cm胃組織置入4％甲

8、醛溶液中固定保存、取0.1cm×0.5cm胃黏膜切成1mm3小塊若干，投人2.5％戊二醛液中固定保存；留胃黏膜約0.5cm×0.5cm稱重；其余部分用生理鹽水沖洗3次，放入去RNA酶的試管中，液氮速凍，深低溫冰箱-70℃保存。每組每時(shí)間點(diǎn)8只。 2.方法: 按Guth標(biāo)準(zhǔn)積分判定胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI)，H-E染色光學(xué)顯微鏡檢查胃黏膜病理改變，透射電鏡觀察胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，采用放射免疫法測(cè)定胃黏膜PGE2

9、濃度，硝酸還原酶的化學(xué)比色法測(cè)定胃黏膜NO含量；免疫組織化學(xué)SP方法測(cè)定pS2、TGF-α、COX-2、iNOS及PC-NA蛋白的表達(dá)，半定量RT-PCR.法測(cè)定pS2、TGF-α、COX-2及iNOSmRNA的表達(dá)。用SPSS 10.0軟件系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用方差分析。 結(jié)果: 一、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及PAF受體拮抗劑對(duì)其影響: 大體觀察LPS組腹腔注射內(nèi)

10、毒素后6 h胃黏膜損傷最重，表面可見大片糜爛、出血、條索狀壞死，與胃縱軸平行，損傷主要見于腺胃區(qū)；光鏡下黏膜表面上皮廣泛脫落，黏膜內(nèi)有出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，核碎裂、固縮，凋亡小體出現(xiàn)，腺體受損。此時(shí)胃黏膜UI記分最高，與對(duì)照組比較或各時(shí)間點(diǎn)比較，差異均非常顯著(P<0.01)；PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組胃黏膜損傷程度明顯減輕，UI記分顯著降低。透射電鏡觀察可見LPS組6 h表面上皮細(xì)胞細(xì)胞間隙增寬，腔膜面破壞，細(xì)胞間緊密連接不連續(xù)，短

11、小的微絨毛減少，線粒體嚴(yán)重腫脹，脊斷裂甚至消失，呈空泡變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫落，染色質(zhì)濃縮分部在核的周邊，可見核固縮，核膜間隙增寬；壁細(xì)胞腫脹，可見鹽酸小管擴(kuò)張，部分有破壞呈空泡樣改變，線粒體增多，部分空泡樣改變，胞質(zhì)內(nèi)核糖體脫落，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。 二、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜COX-2、iNOS、PGE2、NO變化及PAF受體拮抗劑對(duì)其影響: LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜PGE2濃度最低，此時(shí)LPS組較

12、對(duì)照組PGE2濃度明顯降低(P<0.01)，PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較LPS組明顯增高(P<0.01)，PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜NO含量最高，此時(shí)LPS組較對(duì)照組NO含量明顯增高(P<0.01)，PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較LPS組明顯降低(P<0.01)；PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較

13、對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。 對(duì)照組胃黏膜組織未見COX-2、iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h COX-2蛋白在胃黏膜組織胞漿表達(dá)，48 h明顯增高，其mRNA水平亦上調(diào)；PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組6 h COX-2蛋白表達(dá)明顯增高、mRNA水平明顯上調(diào)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后1.5h胃黏膜組織胞漿iNOS蛋白表達(dá)，6 h明顯增高，24 h最高，48 h下降，72 h仍未恢復(fù)正常；其tuRN

14、A水平的表達(dá)變化與iNOS蛋白表達(dá)趨勢(shì)相同。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組3 h iNOS蛋白表達(dá)，6 h明顯增高，48 h下降，72h同正常對(duì)照組；其mRNA水平的表達(dá)變化與iNOS蛋白表達(dá)趨勢(shì)相同。 三、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜pS2、TGF-α和PCNA表達(dá)變化及PAF受體拮抗劑對(duì)其影響: 對(duì)照組胃黏膜組織胞核PCNA陽(yáng)性染色很多，LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后3 h PCNA的表達(dá)就明顯減低，6 h最低，24 h有所恢

15、復(fù)，72 h未完全恢復(fù)正常。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組胃黏膜組織胞核PCNA陽(yáng)性染色無(wú)明顯減少。對(duì)照組胃黏膜組織有pS2 mRNA、TGF-αmRNA表達(dá)。LPS組內(nèi)毒素腹腔注射后1.5 h胃黏膜中pS2基因表達(dá)減弱，3 h恢復(fù)，6 h明顯高于對(duì)照組，24 h最高，48 h-72 h有所下降，但仍明顯高于對(duì)照組。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組3h pS2 mRNA的表達(dá)就明顯增強(qiáng)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6h胃黏膜中TGF-αmRN

16、A的表達(dá)明顯增強(qiáng)，6 h-48h最強(qiáng)，72 h有所下降，仍高于正常對(duì)照組。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組TGF-αmRNA的表達(dá)48 h恢復(fù)正常。免疫組化證實(shí)了胃黏膜pS2、TGF-α表達(dá)變化。 結(jié)論： 1.腹腔注射內(nèi)毒素可致幼年大鼠急性胃黏膜損傷，胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；PAF受體拮抗劑可明顯減輕內(nèi)毒素血癥時(shí)幼年大鼠急性胃黏膜損傷，由此得出PAF可能是引起幼年大鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)急性胃黏膜損傷的重要因素。

17、 2.內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜COX-2 mRNA、iNOS mRNA表達(dá)上調(diào)，COX-2、iNOS蛋白表達(dá)增強(qiáng)。PAF受體拮抗劑可改善COX-2的表達(dá)，下調(diào)iNOS表達(dá)水平，在減輕急性胃黏膜損傷的同時(shí)可能有助于胃黏膜損傷的愈合。 內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜PGE2下降，NO含量增高，誘發(fā)急性胃黏膜損傷；PAF受體拮抗劑可影響胃黏膜PGE2濃度、NO含量，有助于其發(fā)揮對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用。 3.內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜PCNA表達(dá)減少，