BAP1-ASXL1、snu13-U3 snoRNA、CBP bromodomain-H3K56ac的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)發(fā)生在多時(shí)空、多層次的精細(xì)調(diào)控過(guò)程，包括表觀遺傳水平和翻譯水平。組蛋白的翻譯后修飾是重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一，涉及寫(xiě)入器、閱讀器、擦除器的相互作用。BAP1是一種重要的泛素擦除器，可以被ASXL1激活，對(duì)H2AK119ub1去泛素化，從而拮抗PRC1的功能。ASXL1激活BAP1的機(jī)制以及BAP1定位在染色質(zhì)上的機(jī)理尚不清楚。CREBBP bromodomain是一種識(shí)別H3K56ac的組蛋白乙?；喿x器，其識(shí)別的

2、機(jī)理、識(shí)別的環(huán)境、識(shí)別的功能也不明確。除了組蛋白翻譯后修飾，核糖體RNA的加工、成熟直接關(guān)系到蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器核糖體的裝配，也是重要的基因表達(dá)調(diào)控方式。U3 snoRNP核心復(fù)合物對(duì)rRNA進(jìn)行2'-O-methylation修飾，促進(jìn)rRNA的加工和成熟。目前對(duì)真核生物的U3 snoRNP核心復(fù)合物的裝配研究較少。本文從三個(gè)方面對(duì)基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程進(jìn)行探究。
　　BAP1是泛素羧基末端水解酶家族唯一定位在細(xì)胞核的成員，自身具有較低的

3、酶活。ASXL1的DEUBAD結(jié)構(gòu)域能夠激活BAP1，并與BAP1形成PreDUB復(fù)合物對(duì)H2AK 119ub1去泛素化。我們?cè)诖竽c桿菌中嘗試多種方法成功表達(dá)和純化了BAP1與ASXL1 DEUBAD結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物，生長(zhǎng)的晶體最高衍射分辨率為2.6埃。我們發(fā)現(xiàn)BAP1單獨(dú)存在時(shí)趨向于寡聚狀態(tài)，而被ASXL1DEUBAD結(jié)構(gòu)域激活后會(huì)形成穩(wěn)定的異源二聚體，與報(bào)道的胞內(nèi)研究結(jié)果一致。此外，我們用GST pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAP1通過(guò)

4、CTE結(jié)合在完整的核小體上，但不能作用于核小體酸性區(qū)、核小體DNA及游離的組蛋白，解釋了BAP1/ASXL1復(fù)合物定位在染色質(zhì)的機(jī)制。
　　U3 snoRNA屬于box C/D snoRNA，起引導(dǎo)核糖體RNA 2'-O-methylation的作用。U3 snoRNP由U3、snu13、fibrillarin、nop56/58組成，其中fibrillarin是RNA甲基轉(zhuǎn)移酶。復(fù)合物裝配起始于snu 13與U3的box B/C、

5、boxC/D，然后依次招募nop56/68和fibrillarin。我們克隆了snu 13、fibrillarin、 nop56、nop58，并表達(dá)純化了snu13和fibrillarin。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄U3、box B/C和box C/D，用EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了snu13與U3的相互作用。snu13結(jié)合在U3的box B/C，親和力為2.2μM，暗示snu 13還需要結(jié)合boxC/D以提高親和力。此前有研究報(bào)道boxB/C自身為環(huán)(loo

6、p)結(jié)構(gòu)，與snu13結(jié)合才能形成扭結(jié)(Kink-turn，K-turn)結(jié)構(gòu)。我們利用RNA imino氫特殊的化學(xué)位移，發(fā)現(xiàn)在溶液狀態(tài)下U3 box B/C也能形成K-turn結(jié)構(gòu)。結(jié)合以前的研究，我們認(rèn)為snu13通過(guò)構(gòu)象選擇機(jī)制而不是構(gòu)象變化來(lái)結(jié)合U3 box B/C。
　　H3K56ac是一個(gè)位于核小體核心區(qū)的乙?；揎?，在轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程發(fā)揮重要作用，而根據(jù)報(bào)道，CREBBP bromodomai

7、n可能是H3K56ac的閱讀器，但作用機(jī)理不清楚。與徐莉同學(xué)合作，我們解析了CREBBP bromodomain與H3K56ac復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)表明，CREBBP bromodomain識(shí)別H3K56ac的方式類似于其他bromodomain與乙酰化賴氨酸的相互作用，都是通過(guò)一個(gè)疏水口袋、水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和保守的天冬酰胺結(jié)合賴氨酸乙?；瘋?cè)鏈。有意思的是，H3αN在核小體上形成α-helix，而在CREBBP bromodoma

8、in中為伸展?fàn)顟B(tài)。GST pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CREBBP bromodomain不能結(jié)合H3K56乙?；闹亟M核小體，但是能識(shí)別H3/H4 dimer上的H3K56ac，證明了伸展?fàn)顟B(tài)的H3αN的確存在，與之前報(bào)道的H3/H4 tetramer上H3αN構(gòu)象不均一吻合。CREBBP bromodomain能明顯促進(jìn)HAT結(jié)構(gòu)域乙?；疕3K56。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們提出，CREBBP bromodomain從HAT活性中心捕獲