褐飛虱para鈉離子、NlSC1離子通道基因及三個保幼激素合成代謝中關(guān)鍵基因的研究.pdf

1、稻飛虱是亞洲地區(qū)主要的水稻害蟲，通過吸食水稻汁液和傳播水稻病毒造成水稻大面積死亡和減產(chǎn)，給世界糧食安全造成巨大的威脅。近幾十年來，化學(xué)殺蟲劑在控制稻飛虱中起著重要的作用，但是在世界各地區(qū)相繼報道了稻飛虱對各種農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，為了理解道稻飛虱對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制，也為了針對現(xiàn)有靶標(biāo)篩選新的化合物，或?qū)ふ倚碌霓r(nóng)藥靶標(biāo)，我們對除蟲菊酯類農(nóng)藥的靶標(biāo)—鈉離子通道基因、一種新的離子通道——DSC1同源基因和保幼激素合成與代謝途徑中三種關(guān)鍵基因進(jìn)

2、行了研究。
　　 DSC1是一種在結(jié)構(gòu)上與電壓門控鈉離子通道基因相似，但功能上又不同的陽離子通道基因。用DSC1作為搜索序列對GenBank中所有基因組進(jìn)行分析，結(jié)果表明其同源基因在節(jié)肢動物、軟體動物、刺胞動物、半索動物和棘皮動物中均有存在，但主要在節(jié)肢動物（昆蟲綱和甲殼動物）中，但沒有在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)。我們根據(jù)褐飛虱和家蠶的基因組序列，分別克隆了DSC1同源基因，被分別命名為NlSC1和BmSC1，它們分別編碼2122和222

3、5個氨基酸，與DSC1蛋白的同源性達(dá)到50％左右，主要在褐飛虱和家蠶的頭部和觸角表達(dá)。多序列比對和蛋白質(zhì)疏水性分析表明該類蛋白質(zhì)除了具有與電壓門控鈉離子和鈣離子通道蛋白同樣的模塊結(jié)構(gòu)以外，在四個結(jié)構(gòu)域的成空區(qū)有獨特的DEEA模體，在第三與第四結(jié)構(gòu)域之間的環(huán)狀區(qū)還有一獨特保守的MFL模體。系統(tǒng)進(jìn)化分析也進(jìn)一步證明這類基因沒有和鈉離子通道或鈣離子通道聚集在一個分支上，而是形成了一個獨立的分支。鑒于該類離子通道沒有在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，那么針對該

4、類型離子通道的化合物或農(nóng)藥將對脊椎動物沒有危害，所以我們認(rèn)為該類離子通道可能是一個理想的農(nóng)藥靶標(biāo)。
　　 昆蟲的鈉離子通道基因是DTT、除蟲菊酯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的靶標(biāo)基因。用果蠅Para鈉離子蛋白序列在褐飛虱基因組中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)一個同源基因，用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆出來褐飛虱para鈉離子通道基因，對其ORF擴(kuò)增，獲得10種類型，其中最長的ORF長6215 bp，編碼2084個氨基酸.序列比對發(fā)現(xiàn)6個RNA可變剪切位

5、點和10個RNA編輯位點。褐飛虱Para蛋白中包含35個PKA磷酸化位點、47個PKC磷酸化位點和8個N-糖基化位點。實時定量PCR結(jié)果顯示褐飛虱para鈉離子基因主要在觸角和頭部表達(dá)?，F(xiàn)在已經(jīng)有5種克隆正在進(jìn)行電生理試驗，其結(jié)果將對于理解這些RNA可變剪切和RNA編輯的功能提供幫助。
　　 保幼激素在昆蟲的生長、發(fā)育、變態(tài)和繁殖等過程中起著關(guān)鍵作用，為了理解稻飛虱保幼激素合成與代謝途徑，方便針對保幼激素合成與代謝途徑中的酶篩選

6、和合成抑制劑用于農(nóng)藥領(lǐng)域，根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組序列，我們RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了保幼激素環(huán)氧水解酶、保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶和法呢基焦磷酸合成酶等三個關(guān)鍵基因，它們的cDNA全長分別為2114 bp、1144 bp和2214 bp，編碼454、279和393個氨基酸。在昆蟲細(xì)胞中對這三個基因進(jìn)行真核表達(dá)，試驗表明它們分別表達(dá)52、32和45 kDa的蛋白，這與預(yù)期分子大小一致。實時定量PCR結(jié)果表明:保幼激素環(huán)氧水解酶在褐飛虱蛻皮和羽化