超臨界流體萃取技術(shù)提取西青果有效成分及體外抗氧化活性初步研究.pdf

1、本文將超臨界CO2萃取技術(shù)，與丙酮提取和水提取技術(shù)集成使用，即采用固定床連續(xù)性提取法，依次使用超臨界CO2、丙酮和水對(duì)西青果有效成分進(jìn)行提取;采用Folin-Ciocalteu法測定西青果提取物總酚含量，并建立高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)對(duì)提取物中主要酚酸類化合物進(jìn)行質(zhì)量控制;采用3種抗氧化活性方法對(duì)不同溶劑提取物進(jìn)行了體外抗氧化活性初步研究。為西青果的應(yīng)用開發(fā)

2、提供研究基礎(chǔ)。
　　方法及結(jié)果:
　　第一部分 超臨界流體萃取技術(shù)提取西青果有效成分工藝研究
　　方法:
　　1.西青果物理特性考察
　　考察西青果藥材粗粉的粒徑分布、水分含量、真密度、表觀密度和孔隙度五個(gè)物理特性
　　2.固定床連續(xù)性提取工藝
　　在40℃、300bar的條件下，依次使用超臨界CO2(scCO2)、丙酮和水作為溶劑，對(duì)西青果藥材進(jìn)行提取。提取時(shí)間共18h，每20min收集一次提

3、取液。提取液經(jīng)濃縮、干燥后分別得超臨界CO2提取物、丙酮提取物、水提取物。
　　3.固定床一步法提取工藝
　　在40℃、300bar的條件下，僅使用丙酮/水作為溶劑對(duì)西青果藥材進(jìn)行提取。萃取時(shí)間共12h。每30min收集一次提取液，提取液經(jīng)濃縮干燥后分別得到丙酮提取物和水提取物。
　　4.常壓提取工藝
　　在40℃、常壓條件下，采用回流提取法對(duì)西青果藥材進(jìn)行提取。提取液經(jīng)濃縮干燥后分別得到丙酮提取物和水提取物。<

4、br>　　結(jié)果:
　　1.西青果藥材物理特性考察結(jié)果
　　粒徑分布:西青果粒徑分布范圍為34.913％(0～0.1mm)，20.498％(0.1～0.2mm)，16.09％(0.2～0.3mm),11.925％(0.3～0.4mm),5.299％(0.4～0.5mm),7.193％(0.5～0.6mm),1.939％(0.6～0.7mm),1.15％(0.7～0.8mm),0.993％(0.8～1mm)。
　　水分含量

5、:10.86±0.01％.
　　2.固定床連續(xù)性提取工藝結(jié)果
　　固定床連續(xù)性提取工藝各溶劑提取率:超臨界CO2提取率為1.25±0.04％;丙酮提取率為28.15±0.94％;水提取率為33.44±0.56％;總提取率為62.84±1.54％。
　　3.固定床一步法提取工藝結(jié)果
　　固定床一步法提取工藝各溶劑提取率:丙酮提取率為41.28±0.84％;水提取率為55.60±1.41％。
　　4.常壓提取工

6、藝結(jié)果
　　常壓提取工藝各溶劑提取率:丙酮提取率為37.46±1.56％;水提取率為45.52±1.52％。
　　第二部分 西青果提取物總酚及主要酚酸類化合物含量測定研究
　　方法
　　1.總酚含量測定
　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制系列濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入0.5mL福林酚試劑，暗處放置5min后各加入2mL20％Na2CO3溶液，定容至25mL?；靹蚝笫覝乇芄夥胖?h，分別測試溶液在760nm處的光密

7、度值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　2.線性關(guān)系考察
　　將標(biāo)準(zhǔn)品按規(guī)定色譜條件測定訶黎勒酸、沒食子酸、柯里拉京、訶子寧、訶子酸色譜峰峰面積。進(jìn)行線性回歸處理得到?jīng)]食子酸、柯里拉京、訶子寧、訶黎勒酸、訶子酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。
　　3.精密度實(shí)驗(yàn)
　　配置各對(duì)照品低濃度溶液、中濃度溶液、高濃度溶液，按規(guī)定色譜條件下每天平行進(jìn)樣5份，考察其日內(nèi)精密度，并連續(xù)進(jìn)樣3天用于考察其日間精密度

8、。
　　4.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
　　將供試品分兩份，分別放置于-15℃與-4℃下，然后分別對(duì)放置第一天的供試品和放置第三天的供試品按規(guī)定色譜條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別測定訶黎勒酸，訶子酸，沒食子酸，訶寧子，柯里拉京的色譜峰面積并計(jì)算出面積比。
　　5.三種提取工藝樣品五種酚酸類成分的HPLC檢測
　　色譜柱為Ultimate LP-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇（流動(dòng)相A）和0.6％磷酸（流動(dòng)相B），進(jìn)

9、行梯度洗脫，在流速1.2mL/min，檢測波長278nm，柱溫40℃條件下進(jìn)行梯度洗脫。在該色譜條件下測定各供試品溶液五種酚酸類成分的含量。
　　結(jié)果:
　　1.總酚含量測定結(jié)果
　　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.1089X+0.0056，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。沒食子酸在質(zhì)量濃度0-8μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
　　2.線性關(guān)系考察結(jié)果
　　沒食子酸、柯里拉京、訶子寧、訶黎勒酸、訶子酸分別在進(jìn)樣

10、量為0.75-10μg/mL、0.75-10μg/mL、1.2563-20.10μg/mL、2.5125-40.2μg/mL、0.75-10μg/mL的范圍內(nèi)時(shí)線性關(guān)系良好。
　　3.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　日內(nèi)精密度與日間精密度RSD均在5％以內(nèi)，說明方法以及儀器的精密度良好。
　　4.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知標(biāo)準(zhǔn)品在-15℃的時(shí)候較之在-4℃時(shí)穩(wěn)定。
　　5.三種提取工藝樣品五種酚酸類成分HPLC

11、檢測結(jié)果
　　固定床連續(xù)性提取工藝各溶劑五種酚酸類成分收率:超臨界CO2提取的總酚酸收率幾乎忽略不計(jì);丙酮提取的總酚酸收率為17.61±0.37％;水提取的總酚酸收率為10.64±0.43％。丙酮提取了大部分酚酸化合物(約62.34％)，遠(yuǎn)高于水提取的酚酸化合物（約37.66％）。
　　固定床一步法提取工藝各溶劑總酚酸收率:丙酮的總酚酸收率為23.26±0.87％;水提取的總酚酸收率為16.08±0.29％。
　　常壓

12、提取工藝各溶劑總酚酸收率:丙酮提取的總酚酸收率為14.57±0.51％;水提取的總酚酸收率為12.19±0.14％。
　　第三部分 西青果提取物體外抗氧化活性初步研究
　　方法:
　　1.DPPH自由基清除活性測定
　　配制質(zhì)量濃度為100μg/mL的DPPH溶液。各提取物樣品分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、125和250μg/mL的樣品溶液備用。
　　2.ABTS自由基清除活性測定
　　配

13、制在734nm處吸光度值為0.70±0.02的ABTS+·溶液。分別稱取固定床一步法丙酮提取物、水提取物、以及對(duì)照品Vc各40mg，用甲醇配制質(zhì)量濃度為4mg/mL的3種樣品母液。將三種樣品母液分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、40、80、160、320和640μg/mL的樣品溶液備用。
　　3.還原性法測定抗氧化活性
　　分別稱取固定床一步法丙酮提取物、水提取物、以及對(duì)照品Vc各40mg，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為4mg/m

14、L的3種樣品母液。將3種樣品母液分別配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32和0.64mg/mL的樣品溶液備用。以Vc為對(duì)照，甲醇做空白，平行操作實(shí)驗(yàn)3次，采用紫外分光光度法測定溶液在700nm波長處的光密度值。測定的光密度值越高則代表化合物的還原能力越強(qiáng)。
　　結(jié)果:
　　1.DPPH自由基清除活性測定結(jié)果
　　固定床連續(xù)性提取法丙酮提取物和水提取物的EC50值分別為14

15、.94μg/mL和43.45μg/mL。
　　2.ABTS自由基清除活性測定結(jié)果
　　西青果丙酮提取物和水提取物的EC50值分別為20.273μg/mL和33.064μg/mL，Vc的EC50值為17.680μg/mL;由總酚含量和EC50值結(jié)果可以推算出丙酮和水兩種提取方法藥材清除ABTS自由基的EC50值分別為32.583μg/mL和72.282μg/mL，提示以丙酮作為溶劑時(shí)西青果藥材清除ABTS自由基效果是以水作為溶

16、劑的2.22倍。
　　3.還原能力測定結(jié)果
　　西青果丙酮及水提取物的還原能力均表現(xiàn)出與質(zhì)量濃度的相關(guān)性，濃度越高，還原能力越強(qiáng)。表明西青果兩種提取物均有一定的還原力，且丙酮提取物的還原力均大于同等質(zhì)量濃度下水提取物的還原力。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.005～0.04mg/mL時(shí)，兩種提取物光密度值隨質(zhì)量濃度的增加趨于平緩;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.04～0.32mg/mL時(shí)，兩種提取物光密度值快速增加;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.64mg/mL時(shí)，丙酮、

17、水提取物及Vc的光密度值分別為1.877、1.547和2.281。
　　結(jié)論:
　　1.固定床連續(xù)性提取工藝具有更高的效率和收率。西青果提取物總收率為62.84±1.54％，其中超臨界CO2提取率為1.25±0.04％，丙酮提取率為28.15±0.94％，水提取率為33.44±0.56％。較好的提高了西青果萃取的收率。
　　2.采用Folin-Ciocalteu法測定西青果提取物總酚含量，并建立HPLC法同時(shí)測定西青果