吩嗪-1-羧酸降解菌的篩選與分離.pdf

1、新型生物農(nóng)藥申嗪霉素，其有效成分為吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid, PCA），對(duì)甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治具有廣譜、高效、低毒、環(huán)境相容性好、生產(chǎn)成本低等顯著特點(diǎn)。但在生物防治過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，吩嗪-1-羧酸在大田中易被降解，影響其防治效果，因此需要研究吩嗪-1-羧酸的生物降解機(jī)理，了解它的環(huán)境行為，為提高申嗪霉素的防治效果、合理使用申嗪霉素奠定基礎(chǔ)。 本文主要的研究?jī)?nèi)容是篩選與分離吩嗪-1-

2、羧酸降解菌。在研究中發(fā)現(xiàn)，從黃瓜根際土壤、辣椒根際土壤、西紅柿根際土壤、青菜根際土壤、西葫蘆根際土壤，共5份土壤樣品中，經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后得到的富集培養(yǎng)液混合菌群都對(duì)吩嗪-1-羧酸具有良好的降解效果，一般在7天內(nèi)都能完全降解一定濃度（200mg/L）的吩嗪-1-羧酸。由此可以初步推斷，在自然的土壤環(huán)境中，能夠降解吩嗪-1-羧酸的細(xì)菌是廣泛存在的。 接著，本研究以吩嗪-1-羧酸為唯一碳氮源，從“吩嗪-1-羧酸防治辣椒疫霉試驗(yàn)”中的辣椒

3、疫霉發(fā)病植株根際土壤中分離到了96株能夠利用吩嗪-1-羧酸生長(zhǎng)的菌株。通過(guò)16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA），將這96株菌株分為16種類(lèi)型；其中以菌株V-6為代表的ARDRA類(lèi)型a所占的豐度最高，為21.9％，其次是以菌株101為代表的ARDRA類(lèi)型d，該類(lèi)型所占的豐度為16.7％，這兩種ARDRA類(lèi)型可能是環(huán)境中吩嗪

4、-1-羧酸的優(yōu)勢(shì)降解菌。對(duì)16種類(lèi)型的代表菌株的16S rDNA的部分序列（500bp）進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中比對(duì)，分析其在系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)學(xué)上的地位。其中，菌株V-6，204和207分屬于細(xì)菌擬桿菌門(mén)的不同綱目，菌株132屬于放線菌中的紅球菌屬，其它12株菌株分屬于α、β、γ-變形菌綱。16株代表菌株各自單獨(dú)降解吩嗪-1-羧酸的效率比較低，培養(yǎng)35天后的降解率為16.5％～34.6％。降解效率最高的兩株菌株為133和10

5、2，其降解率分別為34.6％和32.9％，與菌株133親緣關(guān)系最近的菌為Pseudomonas alcaligenes，同源性為100％；與菌株102親緣關(guān)系最近的菌為Pseudomonas putida KT2440，同源性為99％。將16株代表菌株等量人為組成混合微生物體系后，其降解效率7天即可達(dá)到26.8％，28天后達(dá)到43.8％，混合菌株的降解效率明顯優(yōu)于單菌。 本文通過(guò)DGGE方法監(jiān)測(cè)混合菌群（該混合菌群為辣椒疫霉試

6、驗(yàn)中辣椒疫霉發(fā)病植株的根際土壤經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、接種到PCA液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的混合菌群）在不同時(shí)段對(duì)吩嗪-1-羧酸的降解過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著吩嗪-1-羧酸的降解，微生物菌群結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的變化，沒(méi)有優(yōu)勢(shì)菌群的出現(xiàn)或者消失。用16S rDNA建庫(kù)測(cè)序分析的方法，分析了具有降解吩嗪-1-羧酸能力的混合微生物菌群的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示， 16S rDNA文庫(kù)可分為18個(gè)OUT，其中與豐度最高的OUT親緣關(guān)系最近的菌是Pseudomonas

7、 sp. BCNU171，同源性為100％。 通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法獲得的16株菌株與不依賴(lài)于培養(yǎng)的16S rDNA建庫(kù)測(cè)序分析方法所得的18個(gè)OUT的序列結(jié)果不一致。分離得到的16種純菌在16S rDNA克隆文庫(kù)中沒(méi)有找到相對(duì)應(yīng)的克隆，意味著在本實(shí)驗(yàn)中傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法與分子生物學(xué)方法鑒定得到的微生物信息存在著很大的差異。 本文首次從土壤中分離得到了吩嗪-1-羧酸降解菌，為進(jìn)一步研究吩嗪-1-羧酸的生物