在銅綠假單胞菌根際株(Pseudomonas aeruginosa rhizosphere strain)M18中高效轉(zhuǎn)化吩嗪-1-羧酸為吩嗪-1-酰胺.pdf

1、銅綠假單胞菌根際株(Pseudomonas aeruginosa rizhosphere strain) M18是所在研究室從甜瓜植物根際分離的一株生防菌株，其主要抗菌代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)是一種黃色晶體，具有高效、廣譜的抗菌活性的含氮雜環(huán)化合物。以PCA為主要成分的微生物源殺菌劑，已經(jīng)由我國(guó)農(nóng)藥命名單位定名為申嗪霉素。申嗪霉素原藥和1％申嗪霉素懸浮劑于2011年獲得了農(nóng)

2、業(yè)部頒發(fā)的正式登記證，農(nóng)業(yè)部已經(jīng)將申嗪霉素列入“十二五”期間全國(guó)推廣產(chǎn)品。但是，PCA對(duì)病源菌的防病效果受使用時(shí)的酸度(pH)值的嚴(yán)重影響，在pH值7.0的條件下，其抗菌活性?xún)H為pH值5.0條件下的20％，在堿性條件下PCA的防病效果大大降低。
　　 吩嗪-1-酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)作為一種PCA的酰胺化衍生物，具有同樣廣譜的抗真菌活性，同時(shí)與PCA相比，PCN的抗真菌的活性不受使用環(huán)境的

3、pH值的影響，在中性和堿性pH環(huán)境中，PCN抗真菌的活性是PCA的5到10倍。PCN是由PCA衍生而來(lái)的，其轉(zhuǎn)化過(guò)程需要谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺轉(zhuǎn)移酶（glutamine phenazine-1-carboxylic acid amidotransferase，PhzH）的催化作用，而基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)促生拮抗菌株M18的基因組中，基因phzH是一個(gè)已經(jīng)發(fā)生點(diǎn)突變的基因。
　　 我們首先分析了菌株M18的代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明M18

4、的基因組中發(fā)生點(diǎn)突變的PhzH沒(méi)有活性;其次，從銅綠假單胞菌PAO1中克隆出有活性的PhzH編碼基因，恢復(fù)M18基因組中的phzH，獲得phzH恢復(fù)株M18H+，HPLC分析結(jié)果顯示在M18H+的發(fā)酵液中產(chǎn)生一種新的不同于PCA的化合物;通過(guò)氯仿萃取和硅膠柱層析分離，獲得了這種新的化合物，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)一步證實(shí)M18H+中新產(chǎn)生的化合物為PCN;對(duì)PCN的溶解度分析表明，它在水、甲醇、乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增加，在水中的溶解度最

5、低，在甲醇中的溶解度最高，同時(shí)與PCA相比，PCN在相同的溶劑中的溶解度都要低于PCA的溶解度，雖然兩個(gè)化合物只有一個(gè)基團(tuán)的差異;初步的抑菌活性分析表明，PCN對(duì)水稻紋枯病的抑菌活性在pH4-8之間保持比較穩(wěn)定，而PCA在pH7時(shí)，抑菌活性急劇降低，只有其在pH5時(shí)的活性的20％，在更高的pH環(huán)境中，抑菌活性則完全消失，這與已有的報(bào)道是相吻合的。為了進(jìn)一步提高PCN的發(fā)酵效價(jià)，我們進(jìn)一步構(gòu)建了PCN的高產(chǎn)菌株，構(gòu)建了PhzH過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒

6、pBBRphzH，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化恢復(fù)了phzH的實(shí)驗(yàn)室已有的高產(chǎn)PCA的工程菌株M18G，獲得高產(chǎn)PCN的生物工程菌株M18G/pBBRphzH，在該菌株中，發(fā)酵48小時(shí)后，發(fā)酵液中PCA基本全部轉(zhuǎn)化為PCN，轉(zhuǎn)化效率為100％，經(jīng)初步發(fā)酵，該工程菌株中PCN的效價(jià)已經(jīng)達(dá)4gL-1。
　　 綜上，本文運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)在假單胞菌M18中實(shí)現(xiàn)了PCA的高效酰胺化為PCN的目標(biāo)，并對(duì)PCN的化學(xué)特性和抗菌活性進(jìn)行了初步分析，初步構(gòu)建了