降鈣素對DH豚鼠自發(fā)性腰椎間盤退變的潛在保護作用及機制.pdf

1、第一部分降鈣素對DH豚鼠自發(fā)性腰椎間盤退變的作用
　　目的：通過分析不同月齡Dunkin Hartley（DH）豚鼠腰椎間盤的組織學變化，探討其是否存在增齡性自發(fā)退變；給予一定劑量降鈣素（calcitonin，CT）干預(yù)，觀察降鈣素對該模型自發(fā)性腰椎間盤退變的防治效果。
　　方法：
　　142只雌性3月齡DH豚鼠隨機分為2大組，對照組24只給予生理鹽水干預(yù)，并分別于實施干預(yù)前（3月齡）、干預(yù)3個月（6月齡）、6個月齡（

2、9月齡）和9個月（12月齡）后處死，實驗組給予降鈣素干預(yù)（8μg/kg/day，密蓋息，諾華制藥），分別干預(yù)3個月、6個月和9個月后處死，兩組每個時間點均處死6只動物。
　　2取 L4-L6腰椎及椎間盤進行脫鈣及常規(guī)石蠟包埋，制備4-?m切片并行VG染色，觀察椎間盤的病理學改變并根據(jù)組織學評分系統(tǒng)對腰椎間盤的退變（lumbar vertebral degeneration，LVD）程度進行評分；測量L5-6椎間盤高度，測量左、中、

3、右三個高度，取平均值，并與L6椎體高度作比；測量骨性終板多孔率以及骨性終板與軟骨終板的比例。
　　結(jié)果：1各組DH豚鼠體重變化：隨著月齡的增高，豚鼠體重逐漸升高，與前一時間點結(jié)果比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；2椎間盤VG染色形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)：對照組3月齡組和6月齡組動物的腰椎間盤組織學無退變表現(xiàn)，9月齡組動物腰髓核較6月齡變窄，部分標本尾側(cè)髓核與纖維環(huán)界限不清，中層部分失染，細胞數(shù)量減少，簇集現(xiàn)象較重；12月齡組椎間盤變

4、形明顯，髓核細胞丟失，粘液變性，纖維環(huán)完整性差，終板軟骨及生長板軟骨與軟骨下骨界限模糊不清，軟骨細胞變形壞死，且排列紊亂，深層有增殖細胞團生成。9月齡CT給藥組與對照組相比纖維環(huán)仍致密及髓核相對飽滿，終板軟骨及生長板軟骨顯著骨化。同月齡CT干預(yù)組動物椎間盤更寬，髓核細胞更多，髓核與纖維環(huán)邊界也更清晰；3椎間盤組織學評分顯示：對照組隨著DH豚鼠月齡增高，評分也不斷升高，3、6月齡組間無明顯差異，其余各組之間評分統(tǒng)計均有顯著差異，具有統(tǒng)計學

5、意義（P<0.05）。12月齡CT給藥組評分顯著低于對照組（P<0.05）；4椎間盤高度：該模型椎間盤高度由3月到6月呈現(xiàn)增高趨勢，9月齡時開始下降，12月齡較9月齡顯著降低（P<0.05），12月齡CT治療組椎間盤高度顯著高于12月齡對照組。椎間盤高度與椎體高度的比值，9月齡對照組較6月齡對照組顯著降低（P<0.05），12月齡CT治療組椎間盤高度與椎體高度的比值顯著高于12月齡對照組（P<0.05）；5骨性終板面積比：9月齡和12月

6、齡對照組骨性終板面積占總終板面積比顯著高于3月齡和6月齡，12月齡CT治療組該比值顯著低于12月齡對照組（P<0.05）。
　　第二部分降鈣素對DH豚鼠腰椎間盤二型膠原、糖胺聚糖以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達的影響
　　目的：通過分析不同月齡DH豚鼠腰椎間盤的組織中二型膠原、蛋白聚糖以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達及降鈣素對其表達的影響，探討該模型基質(zhì)代謝的增齡性變化及降鈣素的作用。
　　方法：
　　142只雌性3月齡D

7、H豚鼠隨機分為2大組，對照組24只給予生理鹽水干預(yù)，并分別于實施干預(yù)前（3月齡）、干預(yù)3個月（6月齡）、6個月齡（9月齡）和9個月（12月齡）后處死，實驗組給予降鈣素干預(yù)（8μg/kg/day，密蓋息，諾華制藥），分別干預(yù)3個月、6個月和9個月后處死，兩組每個時間點均處死6只動物。
　　2取L4-L5腰椎及椎間盤進行脫鈣及常規(guī)石蠟包埋，制備4?m切片，采用免疫組化方法檢測各組L4-5椎間盤髓核和纖維環(huán)中二型膠原、糖胺聚糖以及金屬基

8、質(zhì)蛋白酶-1表達情況，應(yīng)用 Image pro-Plus6.0軟件對免疫組化陽性蛋白表達情況進行積分光密度（integrated optical density, IOD）計算，定量分析各組L4-5椎間盤中陽性細胞表達差異。
　　結(jié)果：1免疫組織化學染色結(jié)果示二型膠原、糖胺聚糖以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1在椎間盤和髓核均有陽性表達，著色淺黃或棕黃色不等，具體表達情況如下：二型膠原在髓核中表達情況：免疫組化染色及 IOD分析結(jié)果示3月齡至

9、9月齡動物二型膠原在髓核中的表達逐漸升高，12月齡動物二型膠原的表達下降，顯著低于9月齡（P<0.05）。12月齡降鈣素干預(yù)組二型膠原在髓核中的表達水平顯著高于對照組（P<0.05）；2二型膠原在纖維環(huán)中表達情況：免疫組化染色及 IOD分析結(jié)果示二型膠原在纖維環(huán)中的表達高峰在6月齡，隨后表達水平開始下降（P<0.05）。12月齡降鈣素干預(yù)組二型膠原在髓核中的表達水平顯著高于對照組（P<0.05）；3糖胺聚糖在髓核中表達情況：免疫組化染色

10、及IOD分析結(jié)果示3月齡至9月齡動物糖胺聚糖在髓核中的表達逐漸升高，12月齡動物糖胺聚糖的表達下降，顯著低于9月齡（P<0.05）。12月齡降鈣素干預(yù)組糖胺聚糖在髓核中的表達水平顯著高于對照組（P<0.05）；4糖胺聚糖在纖維環(huán)中表達情況：免疫組化染色及IOD分析結(jié)果示3月齡至9月齡動物糖胺聚糖在纖維環(huán)中的表達逐漸升高并達到高峰，12月齡動物糖胺聚糖的表達下降，顯著低于9月齡（P<0.05）。12月齡降鈣素干預(yù)組糖胺聚糖在髓核中的表達水

11、平顯著高于對照組（P<0.05）；5基質(zhì)金屬蛋白酶-1在髓核中表達情況：免疫組化染色及IOD分析結(jié)果示3月齡至9月齡動物糖胺聚糖在髓核中的表達逐漸升高，12月齡動物糖胺聚糖的表達下降，顯著低于9月齡（P<0.05）。9月齡降鈣素干預(yù)組糖胺聚糖在髓核中的表達水平顯著高于對照組（P<0.05）；6基質(zhì)金屬蛋白酶-1在纖維環(huán)中表達情況：免疫組化染色及IOD分析結(jié)果示3月齡至9月齡動物糖胺聚糖在髓核中的表達逐漸升高，12月齡動物糖胺聚糖的表達下

12、降，顯著低于9月齡（P<0.05）。6、9和12月齡降鈣素干預(yù)組糖胺聚糖在髓核中的表達水平均顯著低于對照組（P<0.05）。
　　第三部分降鈣素對DH豚鼠椎體骨密度、微觀結(jié)構(gòu)和生物力學性能的影響
　　目的：通過分析不同月齡DH豚鼠椎體骨密度、微觀結(jié)構(gòu)和生物力學性能，探討該模型上述指標的增齡性變化及降鈣素的干預(yù)效果。
　　方法：
　　142只雌性3月齡DH豚鼠隨機分為2大組，對照組24只給予生理鹽水干預(yù)，并分別于實

13、施干預(yù)前（3月齡）、干預(yù)3個月（6月齡）、6個月齡（9月齡）和9個月（12月齡）后處死，實驗組給予降鈣素干預(yù)（8μg/kg/day，密蓋息，諾華制藥），分別干預(yù)3個月、6個月和9個月后處死，兩組每個時間點均處死6只動物，留取所有椎體，檢測以下指標：1骨密度檢測：取L3-L5椎體，去除附著軟組織，雙能X線骨密度儀分別測量豚鼠L3-L5椎體的骨密度。
　　2 Micro-CT分析：取L6椎體行Micro-CT檢測，分析該節(jié)段松質(zhì)骨骨量

14、和微觀結(jié)構(gòu)。感興趣區(qū)為距離兩側(cè)生長版1mm以內(nèi)，直徑1.5mm的圓柱體，計算椎體骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：相對體積（ bone volume/trabecular volume, BV/TV)、骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index, SMI），定量分析椎體骨結(jié)構(gòu)參數(shù)。
　　3生物力

15、學分析：取L2椎體去除附著肌肉及軟組織，打磨成上下面平行，約5mm高標本進行椎體生物力學測定，以0.5 mm/min速度進行壓縮試驗，計算椎體極限負荷（maximum load），屈服應(yīng)力（yield stress），極限應(yīng)力（maximum stress）及彈性模量（elastic modulus）用以評價大鼠腰椎椎體骨組織特性。
　　結(jié)果：1腰椎3-5椎體及其間盤的骨密度檢測結(jié)果：對照組與3月齡比較，6、9和12月齡BMD顯著

16、升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），12月給藥組較相同月齡對照組BMD升高明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。2 Micro-CT檢測結(jié)果：12月齡DH豚鼠BV/TV值顯著低于其余月齡組，Tb.Sp和SMI顯著高于其余月齡組（P<0.05），12月齡給藥組BV/TV顯著高于同月齡對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。3椎體生物力學分析結(jié)果：隨著月齡的增高，對照組最大載荷（maximum load）、最大應(yīng)力（maximum

17、 stress）、屈服強度（yield stress）、彈性模量值升高，與3月齡比較，6、9、12月齡組上述指標顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），6、9、12月齡組之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各月齡給藥組最大載荷（maximum load）、最大應(yīng)力（maximum stress）、屈服強度（yield stress）值均顯著高于同月齡對照組，6月齡給藥組彈性模量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0

18、5）。
　　結(jié)論：
　　1雌性DH豚鼠的IVD存在退變性改變，其病變程度隨動物月齡增長呈現(xiàn)逐漸加重趨勢。因此，DH豚鼠是一種可靠的原發(fā)性IDD動物模型，其在一定程度上反映了人類 IDD的發(fā)生發(fā)展過程，可在此模型基礎(chǔ)上進一步探討IDD發(fā)生的機制及其相關(guān)危險因素。
　　2與9月齡動物相比，12月齡DH豚鼠椎間盤組織中二型膠原、糖胺聚糖的含量顯著下降，基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達水平顯著升高，而降鈣素干預(yù)可顯著抑制上述改變，提示