多梳家族蛋白PHC1在人多能干細(xì)胞基因組穩(wěn)定性中的作用研究.pdf

1、背景：再生醫(yī)學(xué)界領(lǐng)袖之一Richard.GOSS將再生、生命、死亡三者之間的關(guān)系解釋為:“如果沒有再生，就沒有生命，如果處處再生，就沒有死亡”，可見再生是個(gè)體存活維持組織功能的重要機(jī)制?；谌烁杉?xì)胞尤其是人多能干細(xì)胞(humanpluripotent stem cells，hPSCs)含人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem c

2、ells，iPSCs)的再生醫(yī)學(xué)為發(fā)展個(gè)體化醫(yī)療帶來了前所未有機(jī)遇和前景。hPSCs具有在體外無限復(fù)制和向各種譜系細(xì)胞分化的潛能，為治療多個(gè)系統(tǒng)的退行性病變提供可能的種子細(xì)胞用于移植。但是hPSCs應(yīng)用于臨床還存在很多瓶頸，例如研究表明體細(xì)胞重編程過程中過表達(dá)重編程因子后引起的DNA復(fù)制壓力和氧化自由基應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷可以破壞iPSCs的基因組產(chǎn)生基因突變，另一方面hPSCs在快速增殖過程中伴隨著由細(xì)胞代謝和DNA復(fù)制活躍產(chǎn)生的活性

3、氧自由基(ROS)也可以導(dǎo)致DNA損傷從而產(chǎn)生基因突變，移植攜帶基因突變的細(xì)胞到體內(nèi)后可能產(chǎn)生腫瘤。因此研究hPSCs如何維持基因組的穩(wěn)定性對于獲得更安全的hPSCs用于細(xì)胞治療十分重要。相比于體細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的研究，關(guān)于hESCs和iPSCs如何維持基因組穩(wěn)定性的報(bào)道卻不多，目前的研究發(fā)現(xiàn)hPSCs維持基因組穩(wěn)定性的主要機(jī)制為:一.ESCs內(nèi)線粒體數(shù)量較低，同時(shí)ESCs主要通過不依賴于線粒體氧化磷酸化的糖酵解代謝方式獲得能量，因此

4、產(chǎn)生的ROS水平很低，另外ESCs高表達(dá)抗氧化相關(guān)基因，因此具備更強(qiáng)的抗ROS導(dǎo)致的DNA損傷能力;二.ESCs在DNA損傷時(shí)會(huì)發(fā)生分化和凋亡清除無法完成損傷DNA修復(fù)的細(xì)胞群體。本課題研究了多梳家族蛋白PHC1在hESCs基因組穩(wěn)定性維持中的作用。我們的研究結(jié)果顯示利用shRNA沉默PHC1的表達(dá)后可以降低NANOG的表達(dá)水平，提示PHC1可能參與hESCs的干性維持;進(jìn)一步通過紫外輻射和阿霉素處理誘導(dǎo)DNA損傷后，敲降PHC1后的h

5、ESCs對DNA損傷更敏感。另外，以前的研究表明過表達(dá)重編程因子引起的DNA損傷反應(yīng)是體細(xì)胞重編程的一個(gè)重要障礙。我們的結(jié)果顯示在人體細(xì)胞重編程過程中敲降PHC1的表達(dá)后引起細(xì)胞凋亡增加、周期阻滯，從而降低重編程的效率，提示PHC1參與了多能性形成過程中細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)。
　　第一部分、PHC1在hESCs干性維持中的作用
　　目的:研究PHC1對于多能性維持的作用。
　　方法:利用qPCR和western blo

6、t檢測PHC1在hPSCs與分化細(xì)胞中的表達(dá)差異，構(gòu)建PHC1 shRNA在hESCs中沉默PHC1基因表達(dá)后檢測多能性基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:PHC1在hPSCs中的表達(dá)高度富集。成功構(gòu)建了在HFF和hESCs中有良好敲降效果的PHC1 shRNA。hESCs中沉默PHC1基因表達(dá)后多能性基因OCT4和NANOG在轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯差異，但NANOG蛋白水平表達(dá)有一定降低。
　　結(jié)論:PHC1對于hESCs多能性維持具有

7、一定的作用。
　　第二部分、PHC1對于維持hESCs基因組穩(wěn)定性的作用
　　目的:建立誘導(dǎo)hESCs DNA損傷的模型，探索敲降PHC1后hESCs對DNA損傷修復(fù)的反應(yīng)。
　　方法:沉默PHC1基因表達(dá)后，分別采用紫外(UV)輻射，阿霉素(Dox)處理誘導(dǎo)hESCs DNA損傷模型，檢測細(xì)胞凋亡水平變化細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:對比載體對照組，敲降PHC1可以造成hESCs基因組穩(wěn)定性下降，對DNA損傷敏感度

8、增加。
　　結(jié)論:PHC1對hESCs基因組穩(wěn)定性維持具有一定作用。
　　第三部分、PHC1在人體細(xì)胞重編程中的作用
　　目的:探討PHC1在過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程中的作用。
　　方法:建立利用慢病毒載體過表達(dá)OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC重編程人成纖維細(xì)胞為iPSCs的體系，檢測沉默PHC1表達(dá)后對重編程效率的影響。
　　結(jié)果:重編程過程中沉默PHC1后引起細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡增加以