2015年--外文翻譯--從成人肝臟細(xì)胞取得的基因組穩(wěn)定的雙潛能干細(xì)胞的長期培養(yǎng)（譯文）

1、<p><b>　　中文7400字</b></p><p>　　出處：Huch M, Gehart H, Vanboxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver[J]. Cell, 2015, 160(1-2):299-312.</p&g

2、t;<p>　　從成人肝臟細(xì)胞取得的基因組穩(wěn)定的雙潛能干細(xì)胞的長期培養(yǎng)</p><p>　　Meritxell Huch,1,9,10,* Helmuth Gehart,1,9 Ruben van Boxtel,1,9 Karien Hamer,1 Francis Blokzijl,1 Monique M.A. Verstegen,2</p><p>　　Ewa Ellis,

3、7 Martien van Wenum,3 Sabine A. Fuchs,4 Joep de Ligt,1 Marc van de Wetering,1,8 Nobuo Sasaki,1</p><p>　　Susanne J. Boers,4 Hans Kemperman,5 Jeroen de Jonge,2 Jan N.M. Ijzermans,2 Edward E.S. Nieuwenhuis,4<

4、;/p><p>　　Ruurdtje Hoekstra,3 Stephen Strom,6 Robert R.G. Vries,1,8 Luc J.W. van der Laan,2 Edwin Cuppen,1 and Hans Clevers1,*</p><p>　　1Hubrecht Institute-KNAW, University Medical Centre Utrecht,

5、CancerGenomics.nl, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands</p><p>　　2Department of Surgery, Erasmus MC-University Medical Center, Postbus 2040, 3000 CA Rotterdam, the Netherlands</p><p>

6、　　3Surgical Laboratory, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Academic Medical Center, Meibergdreef 9, 1105 AZ Amsterdam,the Netherlands</p><p>　　4Division of Pediatric Gastroenterology, Wilhel

7、mina Children’s Hospital, University Medical Center Utrecht, Lundlaan 6, 3584 EA Utrecht,</p><p>　　the Netherlands</p><p>　　5Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical

8、Center Utrecht, Lundlaan 6, 3584 EA Utrecht, the Netherlands</p><p>　　6Division of Pathology, Department of Laboratory Medicine, Karolinska Institute, Alfred Nobels Alle 8, F 56 141-86 Stockholm, Sweden</

9、p><p>　　7Unit for Transplantation Surgery, Department of CLINTEC, Karolinska Institute, Karolinska University Hospital Huddinge, Ha¨ lsova¨ gen,</p><p>　　Flemingsberg, SE-141 86 Stockholm

10、, Sweden</p><p>　　8Hubrecht Organoid Technology (HUB), Uppsalalaan 8, 3584CT, Utrecht, the Netherlands 9Co-first author</p><p>　　10Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Insti

11、tute, Wellcome Trust/MRC Stem Cell Institute and Department of</p><p>　　Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, Tennis Court Road, CB2 1QN Cambridge, UK</p><p>　　*Corr

12、espondence: m.huch@gurdon.cam.ac.uk (M.H.), h.clevers@hubrecht.eu (H.C.)</p><p>　　http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.050</p><p>　　This is an open access article under the CC BY license (ht

13、tp://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　雖然人的肝臟有著巨大的復(fù)制潛能，但是現(xiàn)在仍舊沒有一個(gè)完整的系統(tǒng)可以在體外維持肝細(xì)胞的功能和復(fù)制。我們在前面已經(jīng)證實(shí)了單個(gè)小鼠的Lgr5+肝臟干細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增分化為上皮類器官，也可以在體內(nèi)和體外被擴(kuò)增并分化為功能肝細(xì)胞

14、。我們現(xiàn)在描述的是能使這種從人肝臟獲得的成人膽管衍生的雙潛能祖細(xì)胞長期擴(kuò)增的條件。擴(kuò)增的細(xì)胞在染色體和結(jié)構(gòu)層面高度穩(wěn)定，堿基改變只有非常低的概率。這些細(xì)胞可以非常容易的在體外被轉(zhuǎn)化成功能性肝細(xì)胞，并且在體內(nèi)移植。α1-抗胰蛋白酶缺乏癥和Alagille綜合征的病人得來的類器官反映了體內(nèi)的病理。對初級成人肝臟干細(xì)胞的長期無性擴(kuò)增開辟了疾病模型建立、毒理學(xué)研究、再生性藥物還有基因療法等實(shí)驗(yàn)的新途徑。</p><p>

15、<b>　　簡介</b></p><p>　　肝臟主要由兩種上皮細(xì)胞組成——肝細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞。肝細(xì)胞合成必需的血清蛋白、控制代謝并為各種各樣內(nèi)源性或者外源性的分子解毒。（Duncan et al.,2009）雖然肝細(xì)胞在體內(nèi)有巨大的復(fù)制能力（Michalopoulos,2014），但是它們卻抑制體外長期培養(yǎng)。（Mitaka,1998）事實(shí)上，一個(gè)近期的研究描述了一個(gè)人肝臟細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，這個(gè)培

16、養(yǎng)持續(xù)了一周，卻只擴(kuò)增了10倍。（Shan et al.,2013）作為替代品，人胚胎干細(xì)胞（hES）和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPS）都曾分化成肝細(xì)胞樣的細(xì)胞。然而，最近的報(bào)告結(jié)果意味著肝細(xì)胞的在引導(dǎo)和重新編排過程中發(fā)生了遺傳和表觀遺傳畸變。（Liang and Zhang,2013;Pera,2011;Lund et al.,2012）這些畸變可能是染色體突變（Laurent et al.,2011），從頭復(fù)制的基因拷貝數(shù)變異（Huss

17、ein et al.,2011）和蛋白編碼區(qū)的點(diǎn)突變（Gore et al.,2011）。這些改變可能會(huì)使把它們用作再生性藥物的過程變得更加復(fù)雜。</p><p>　　我們最近研發(fā)出了一種培養(yǎng)系統(tǒng)，它可以使成年小鼠單個(gè)腸（Sato et al.,2009）、胃（Barker et al.,2010）、肝臟 (Huch et al.,2013b)和胰腺（Huch et al.,2013a）干細(xì)胞長期擴(kuò)增（大于一年）

18、。Lgr5是wnt配體R-spondins的受體(Carmon et al., 2011; de Lau et al., 2011)，它在這些老鼠的組織中標(biāo)記了成年干細(xì)胞(Barker et al., 2007, 2010; Huch et al.,2013a, 2013b)。這些培養(yǎng)品仍然維持它們自身原有的組織。我們最近采用了這項(xiàng)技術(shù)來培養(yǎng)人腸的干細(xì)胞（Jung et al.,2011;Sato et al.2011），并且證明了來自

19、患者的腸類器官概括了腸遺傳病的病理。(Bigorgne et al., 2014; Dekkers et al., 2013; Wiegerinck et al., 2014)這里，我們正在尋求建立一種人肝臟的類器官的培養(yǎng)系統(tǒng)。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　人肝臟干細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化</p><p>　　我們限定的

20、小鼠肝臟培養(yǎng)基(ERFHNic [Huch et al., 2013b])只能供人肝臟細(xì)胞存活2-3周（圖表 1A和1B和圖表S1A，頂部，可在線獲取）。在小鼠肝臟培養(yǎng)基上的人肝臟培養(yǎng)物的基因表達(dá)樣本檢測出高活性的Tgf-β信號。像CTGF、PLAT、TIMP1和TIMP2這樣的Tgf-β靶向基因都高度表達(dá)，而Tgf-β絡(luò)合物（LTBP2和LTBP3）和Smad4抑制因子（SMURF1和SMURF2）（Massague´ et

21、 al., 2005）都未有實(shí)質(zhì)性發(fā)現(xiàn)。（圖像S1B）Tgf-β信號引發(fā)生長阻滯還有上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（Xu et al.,2009）。小分子抑制劑A8301對Tgf-β受體Alk4/5/7的特異性抑制下調(diào)了CTGF、TIMP2、PLAT（圖表S1C），延長了培養(yǎng)的時(shí)間（~6-7周，6-7次分裂）（圖表1B），并且提高了菌落形成的效率（圖表1D）。但是培養(yǎng)物最終仍舊退化了（圖表1B和1C左側(cè)）。干細(xì)胞標(biāo)記LGR5的表達(dá)隨時(shí)間減少

22、，而像ALB或者CYP3A4這樣的分化標(biāo)記上調(diào)了（沒有給出數(shù)據(jù)）。說明我們的實(shí)驗(yàn)條件在促進(jìn)分化。</p><p>　　然后我們測試了其他的化合物來引發(fā)細(xì)胞的增殖和LGR5的表達(dá)（表格S1）。增殖的膽管祖細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)的時(shí)候(Furuyama et al.,2011)和受到傷害之后(Dorrell et al., 2011; Huch et al.,2013b; Shin et al., 2011)都出現(xiàn)了。由于FSK

23、這種cAMP通路激動(dòng)劑在體內(nèi)會(huì)引發(fā)膽管細(xì)胞的增殖(Francis et al., 2004)，我們不禁提出這樣的問題：cAMP會(huì)促進(jìn)人肝臟細(xì)胞培養(yǎng)嗎？</p><p>　　FSK的加入會(huì)上調(diào)LGR5和導(dǎo)管標(biāo)記KRT19，而ALB和CYP3A4會(huì)減少（圖表S1D）。集落形成效率本質(zhì)上并沒有改變（圖表1D），然而培養(yǎng)物擴(kuò)張后就像正在生長中的經(jīng)過數(shù)月（大于6個(gè)月）培養(yǎng)的類器官，它每周分裂比是1:4到1:6（圖表1B和1

24、C右側(cè)）。相似的情況也在其他cAMP激動(dòng)劑（8-BrcAMP，霍亂毒素或者NKH477）中被觀察到（圖表S1E）。去掉Wnt激動(dòng)劑R-spo或者通過porcupine抑制（IWP-2）阻塞Wnt分泌都會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)物的快速流失。（圖表S1F-S1H）這種效果會(huì)被外源性增加的Wnt所補(bǔ)救。（圖表S1H）12個(gè)額外的健康人類供體肝臟活檢在改良的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用時(shí)一致性的翻倍，達(dá)到了將近60小時(shí)，與培養(yǎng)物的年齡相互獨(dú)立。（圖表1E和1F，表格S2

25、）Edu檢測確定了這些細(xì)胞在3個(gè)月以上的時(shí)間內(nèi)還保持著他們體外增殖的狀態(tài)。培養(yǎng)物可以非常容易的被凍結(jié)和解凍。（沒有顯示數(shù)據(jù)）因此，Wnt信號，cAMP的激活和Tgf-β的抑制是長期擴(kuò)增必不可少的因素。</p><p>　　來自于導(dǎo)管細(xì)胞的類器官</p><p>　　供體肝臟的膠原酶灌注使得我們能夠取得大量新鮮的、存活的并且還具有功能的人類肝細(xì)胞(Gramignoli et al., 201

26、2)（圖表S2A）我們應(yīng)用EpCAM來把肝細(xì)胞（EpCAM-）從導(dǎo)管EpCAM+導(dǎo)管細(xì)胞中差異性分離。（圖表1H,S2B,S2C）(Schmelzer et al., 2007; Yoon et al., 2011)雖然肝細(xì)胞沒有形成任何類器官，但是EpCAM+膽管細(xì)胞卻以28.4% ± 3.2%的驚人效率發(fā)展成類器官。（圖表1H,S2D,S2E）粗肝細(xì)胞制劑長成類器官結(jié)構(gòu)的效率等同于EpCAM+細(xì)胞的數(shù)量。（圖表S2F和S2

27、G）在我們的培養(yǎng)系統(tǒng)里，不是肝細(xì)胞，而是導(dǎo)管細(xì)胞形成了類器官。</p><p>　　克隆的類器官遺傳性穩(wěn)定</p><p>　　培養(yǎng)了3個(gè)月的類器官保持著正常的染色體數(shù)目（圖表3A,S4A）。從兩個(gè)供體那里我們得到了在容器里解離并培養(yǎng)了7天的活檢樣本。接下來，我們分離了單個(gè)細(xì)胞并為這兩個(gè)肝臟來源的細(xì)胞建立兩個(gè)獨(dú)立的克隆系。（培養(yǎng)物A,培養(yǎng)物B）三個(gè)月對這些培養(yǎng)物擴(kuò)增之后，第二個(gè)克隆步驟執(zhí)行

28、完畢。于是我們可以判定在一個(gè)細(xì)胞的活體中、分離后和3個(gè)月培養(yǎng)中所有基因改變的累積。（圖表2A和2B）</p><p>　　我們觀察到每組培養(yǎng)物中有720-1424個(gè)堿基替代，其中63-139個(gè)堿基在3個(gè)月的培養(yǎng)里出現(xiàn)。（圖表2C）因此，大多數(shù)識別出來的堿基替換是在體內(nèi)（活著的時(shí)候）的或者在類器官形成時(shí)候出現(xiàn)的，而不是培養(yǎng)時(shí)候出現(xiàn)的。這些數(shù)字與已經(jīng)發(fā)表了的數(shù)據(jù)相比怎么樣呢？iPS細(xì)胞與他們的父代體細(xì)胞相比，包含10

29、58-1808個(gè)從頭合成的堿基替換（取決于通路步驟的第15到25步）。（Cheng et al.,2012）值得注意的是，從這些研究得來的數(shù)字不包括在體內(nèi)的父代體細(xì)胞種獲得的變異。因此，肝細(xì)胞類器官3個(gè)月的體外擴(kuò)增比iPS細(xì)胞重新編排少了10倍的堿基替換。在所有的堿基替換數(shù)目中，只有一少部分是鎖定在蛋白編碼DNA上的（每組培養(yǎng)物7到9個(gè)堿基替換；圖表2D,S3）。除了一個(gè)在來自供體2的培養(yǎng)物A上的同義突變（表格S3），在早期克隆培養(yǎng)物中

30、所有的突變都存在了，說明他們不是在3個(gè)月的擴(kuò)增中出現(xiàn)的。這些突變的基因沒有一個(gè)是出現(xiàn)在COSMIC數(shù)據(jù)庫里的（表格S3）。在iPS細(xì)胞里，每個(gè)鏈平均有6個(gè)堿基替換影響蛋白編碼DNA(Cheng et al., 2012; Gore et al., 2011)。</p><p>　　接下來，我們在WGS數(shù)據(jù)中尋找結(jié)構(gòu)變異。我們沒有觀察到任何染色體畸變（圖表3B）。我們在一個(gè)肝細(xì)胞類器官培養(yǎng)物中觀察到兩個(gè)基因拷貝數(shù)變

31、異（CNVs），雜交獲得。（圖表3C）哎其他的培養(yǎng)物中，我們沒有發(fā)現(xiàn)任何CNV（圖表3D和S4B-S4D）。更確切的說，這兩個(gè)CNVs在早期培養(yǎng)物中就已經(jīng)存在了，因此它們不是在長期培養(yǎng)中獲得的。ES細(xì)胞培養(yǎng)物都會(huì)表現(xiàn)出變異的染色體組型(Baker et al., 2007)，并且iPS細(xì)胞能容納相當(dāng)大數(shù)目的體細(xì)胞基因拷貝數(shù)變異(Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011; Martins-Tay

32、lor et al., 2011; Mayshar et al., 2010;Abyzov et al., 2012)。</p><p>　　在體外和移植后分化成功能性肝細(xì)胞</p><p>　　干細(xì)胞標(biāo)記PROM1和LGR5，還有導(dǎo)管標(biāo)記（SOX9，OC2）和肝細(xì)胞標(biāo)記（HNF4a）都非常容易的表達(dá)。（圖表4A，S5A,S5B）從組織學(xué)上講，肝細(xì)胞類器官展示出像導(dǎo)管樣的顯型，可以表現(xiàn)為（

33、1）單層上皮細(xì)胞，表達(dá)出細(xì)胞角質(zhì)蛋白標(biāo)記KRT19和KRT7，或者（2）有無極性的E-Cadherin+HNF4a+和一些KRT7+細(xì)胞的假復(fù)層上皮細(xì)胞（圖表4B-4D）。SOX（圖表4E）和EPHB2（圖表4F）幾乎在所有細(xì)胞中都可以被檢測到，而LGR5只能在EPHB2+的群落里檢測到（圖表4F）。類器官不能表達(dá)像Albumin或者CYP3A4這樣的成熟肝細(xì)胞的標(biāo)記（圖表4A和5C，EM條）。因此，我們確定了人細(xì)胞分化培養(yǎng)基（DM）（

34、表格S1）。去掉生長刺激物R-spo和FSK會(huì)導(dǎo)致Albumin和CYP3A4的上調(diào)（圖表S5C）。之后我們往這個(gè)培養(yǎng)基里加入了Notch抑制劑DAPT(Huch et al., 2013b)，F(xiàn)GF19(Wu et al., 2011),還有dexamethasone(Rashid et al., 2010) (Figure S5D)。BMP7 據(jù)報(bào)道會(huì)加速肝</p><p>　　為了測試類器官在體內(nèi)作為肝細(xì)胞

35、移植的能力，我們?yōu)橛蠧CL4retrorsine的Balb/c裸鼠手術(shù)引入急性肝損傷。這個(gè)手術(shù)需要肝移植。(Guo et al., 2002; Schmelzer et al.,2007)使用人特異性抗體（圖表S6A），我們最初在移植后2小時(shí)和2天的時(shí)候檢測到KRT19陽性的導(dǎo)管樣的細(xì)胞，分布在整個(gè)肝實(shí)質(zhì)。（圖表S6B）在隨后的時(shí)間點(diǎn)上，我們觀察到ALB+，KRT19-人類細(xì)胞，單個(gè)或者成對的，或者更少的，成更大的肝細(xì)胞病灶（圖表6H,

36、S6C）。需要注意的是，我們的損傷模型在移植后對移植的擴(kuò)張沒有任何刺激。人白蛋白和α-1-antitrypsin都在7-14天內(nèi)受體小鼠的血清中以高水平被發(fā)現(xiàn)，并且在60多天里的六分之五的小鼠和在120多天里五分之二的動(dòng)物中維持穩(wěn)定。（圖表6I，S6D,S6E）雖然人主肝細(xì)胞移植最初產(chǎn)生的人白蛋白含量非常高，（圖表6I）但是在一個(gè)月內(nèi)含量就趨近于移植的類器官。</p><p>　　病人類器官模型發(fā)病機(jī)制</

37、p><p>　　α-1-antitrypsin（A1AT）缺乏癥是一種遺傳病，它使得患者更容易得慢性阻塞性肺病和慢性肝病(Stoller and Aboussouan, 2005)。A1AT是從肝臟分泌出來用來從中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶那保護(hù)肺免受蛋白水解損傷。最經(jīng)常的突變是Z allele (Glu342Lys) of the SERPINA1 gene，它會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)A1AT的錯(cuò)誤折疊的積累。ZZ突變的表型是血漿中

38、蛋白質(zhì)減少80%，這隨后會(huì)造成肺氣腫(Stoller and Aboussouan, 2005)。三個(gè)被診斷為A1AT缺乏的病人的活檢（表格S2，圖表S7A）受到組織學(xué)的刻畫，RNA和DNA的分離還有培養(yǎng)的擴(kuò)增。在培養(yǎng)基里，類器官都生長超過4個(gè)月，并且表現(xiàn)正常?；虮磉_(dá)分析顯示出在DM里細(xì)胞分化正常。（圖表S7B）功能性測試顯示，已經(jīng)分化了的從A1AT病人得來的細(xì)胞分泌高含量的白蛋白，并且像健康的供體來源的類器官培養(yǎng)物一樣占據(jù)LDL（圖

39、表7B-7D）。在A1AT缺乏中，肝病的分子學(xué)發(fā)病機(jī)理與肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里蛋白質(zhì)聚集相關(guān)。(Lawless et al., 2008)A1AT蛋白聚集在分化的類</p><p>　　使用Alagille綜合征（AGS）病人的活檢，我們測試了膽道樹的結(jié)構(gòu)缺陷是否也可以用來建模。AGS是缺口信號通路突變導(dǎo)致的，它會(huì)導(dǎo)致部分或者全部膽道閉鎖。(Kamath et al., 2013)病人的類器官在未分化狀態(tài)是與他們健康的器

40、官是同步的。 然而，在分化成單細(xì)胞的時(shí)候去掉R-spondin，Nicotinamide, TGFbi, 和FSK，AGS病人類器官不能上調(diào)單細(xì)胞標(biāo)記，諸如KRT19和KRT7（圖表S7E）。對KRT19的染色顯示膽管細(xì)胞非常稀少，并且不能整合到上皮細(xì)胞中。相反，它們聚成一團(tuán)，然后在類器官腔中凋亡。（圖表S7F）。在AGS老鼠模型中，JAGGED-1/NOTCH2在膽道譜系規(guī)范中是非必需的，但是在膽道形成過程中是必須的。(Geisler

41、 et al., 2008; McCright et al.,</p><p>　　2002)因此，AGS肝類器官構(gòu)成了研究Alagille綜合征的第一個(gè)3D人類模型系統(tǒng)。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　肝疾?。◤幕蜻z傳疾病到病毒性肝炎、肝癌還有和肥胖相關(guān)的脂肪肝）在美國主要死因中排名第十二。(Heron, 2

42、012)不能解決肝病這個(gè)問題還要?dú)w咎于供體肝的缺乏(Vilarinho and</p><p>　　Lifton, 2012)，還有我們對于肝病理機(jī)制理解的不全面。作為疾病模型或者作為細(xì)胞移植治療來源而培養(yǎng)的任何細(xì)胞，評判它們的價(jià)值依靠的是它們擴(kuò)增潛能的保真度和穩(wěn)健性，也依靠它們保持正常基因和表觀遺傳狀態(tài)的能力。(Pera, 2011).hESC分化的可能性還有成纖維細(xì)胞（iPS）重新編程為從神經(jīng)細(xì)胞到肝細(xì)胞的任

43、何分化的細(xì)胞類型，使得包括A1AT-D在內(nèi)的許多人類基因疾病的建模成為可能。(Rashid et al., 2010)然而，培養(yǎng)的干細(xì)胞遺傳的不穩(wěn)定性引起了人們對于它們是否能在細(xì)胞移植治療中安全使用的擔(dān)憂。(Bayart and Cohen-Haguenauer, 2013).</p><p>　　這里，我們展示的是初代人膽管細(xì)胞可以非常容易的在體外擴(kuò)增為雙潛能干細(xì)胞從而形成3D的類器官。這些細(xì)胞在體外分化成功能

44、性肝臟細(xì)胞并且生產(chǎn)移植后的真正的肝臟細(xì)胞。體外培養(yǎng)的類器官的遺傳穩(wěn)定性的廣泛分析表明，在培養(yǎng)的數(shù)個(gè)月里，擴(kuò)增的細(xì)胞保持他們遺傳完整性。這些結(jié)果與我們先前對老鼠的觀察相吻合(Huch et al.,2013b)，但卻與最近出版物中所描述的那種利用多譜系追蹤的方法，導(dǎo)管干細(xì)胞不能促進(jìn)老鼠肝細(xì)胞重生的說法形成了鮮明的對比。(Schaub et al., 2014; Yanger et al., 2014; Yanger et al., 201

45、3)。我們的結(jié)果就像是斑馬魚和大鼠模型展示的內(nèi)容一樣：在肝細(xì)胞近乎完全缺失或者增生被阻斷的情況下，膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了肝細(xì)胞。(Choi et al., 2014) (Michalopoulos, 2014)我們的數(shù)據(jù)在人類爆發(fā)性肝衰竭中被進(jìn)一步證實(shí)。在這種爆發(fā)性肝衰竭中有80%以上的肝細(xì)胞缺失，可以觀察到大量增生的EpCAM+膽上皮細(xì)胞。(Hattoum et al., 2013)</p><p>　　從A1A

46、T-缺乏的患者得來的類器官可以在體外擴(kuò)增并且模仿體內(nèi)的病理。相似的，從Alagille綜合征患者得來的類器官會(huì)重新產(chǎn)生在現(xiàn)在這些患者膽道有的那種的結(jié)構(gòu)性缺陷。用CRISPR/Cas9同源重組的技術(shù)進(jìn)行修復(fù)在類器官培養(yǎng)中是可行的，就像我們最近對囊性纖維化患者的結(jié)腸干細(xì)胞的展示一樣。(Schwank et al.,2013)許多單基因遺傳病都會(huì)影響肝臟，而這些遺傳病都應(yīng)該是服從體外對克隆的肝臟祖細(xì)胞進(jìn)行基因修復(fù)途徑?？傊?，我們的結(jié)果使人們可

47、以開始使用在體外擴(kuò)增的人肝臟材料來實(shí)驗(yàn)。這種材料是替代供體肝細(xì)胞的新的用來研究肝臟重生，肝臟疾病機(jī)制，細(xì)胞移植療法，毒理學(xué)研究或者毒物測試的肝細(xì)胞來源。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p><b>　　人肝臟類器官培養(yǎng)</b></p><p>　　從供體那里得到肝臟活檢(0.5–1 cm3)，肝臟

48、外植體是從在Erasmus MC, Rotterdam做的肝臟移植中得到的。Erasmus醫(yī)療中心的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)了這個(gè)材料的研究性使用。我們也已經(jīng)獲得所有病人的知情同意。對于EPCAM分類實(shí)驗(yàn)和肝細(xì)胞的分離，初代人肝組織的獲取是經(jīng)過知情同意的，也得到了區(qū)域倫理委員會(huì)Karolinska機(jī)構(gòu)的CLINTEC分部的允許(Dnr: 2010/678-31/3) (Jorns et al., 2014).。用accutase膠原蛋白酶消化肝

49、細(xì)胞，將它從人肝臟活檢（0.5-1cm3）中分離出來，就像擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟描述的那樣。不同的部分是混合到一起的，我們用冷的高級DMEM/F12清洗并在300-400轉(zhuǎn)速下離心5分鐘。將細(xì)胞團(tuán)與基質(zhì)膠（BD Biosciences）或者簡化的生長因子BME2（2型基底膜提取物，Pathclear）混合，3000-10000個(gè)細(xì)胞接種到48孔板的一個(gè)孔里。這用的是無連接的板（Greiner）。在基質(zhì)膠或者BME凝固之后，加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是基于

50、AdDMEM/F12 (Invitrogen)，補(bǔ)充了1%的N2，1%</p><p>　　生長曲線和擴(kuò)增比在擴(kuò)充實(shí)驗(yàn)步驟中被具體展示和計(jì)算。</p><p>　　分離EpCAM+ Cells 和Single-Cell Culture</p><p>　　細(xì)胞懸浮液的制備同擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟，將它用抗人CD326（EpCAM）染色，在Moflo分選機(jī)(Dako Cytom

51、ation)中分類，之后的4天里，像上面描述的那樣補(bǔ)充Y-27632 (10 mM, Sigma Aldrich)到培養(yǎng)基后培養(yǎng)。傳代是在分裂比為1:4-1:8，每星期一次。</p><p>　　對于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，單細(xì)胞懸液用FSC和脈沖寬度來分類，區(qū)分單個(gè)細(xì)胞。用碘化丙啶染色來標(biāo)記死亡細(xì)胞還有FSC：脈沖庫寬度門控來排除雙峰細(xì)胞(MoFlow, Dako)分出來的細(xì)胞被種到基質(zhì)膠和96孔板上，每孔一個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞

52、培養(yǎng)如上所述。</p><p>　　肝細(xì)胞分化和體外功能性研究</p><p>　　肝類器官被種下，并在上面所說的肝臟培養(yǎng)基（EM，擴(kuò)增培養(yǎng)基）中，并且補(bǔ)充了BMP7 (25 ng/ml之后，保存7-10天。然后培養(yǎng)物被分離、接種到相應(yīng)的補(bǔ)充有BMP7的EM中，存放至少2-4天。然后，培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基（DM）：AdDMEM/F12 培養(yǎng)基補(bǔ)充有 1%的 N2</p>&l

53、t;p>　　和 1%的 B27，含有 EGF (50 ng/ml),胃泌素 (10 nM, Sigma), HGF(25 ng/ml), FGF19 (100 ng/ml), A8301 (500 nM), DAPT (10 uM), BMP7(25 ng/ml),還有dexamethasone (30 uM)。分化培養(yǎng)基每11-13天換2-3次。</p><p>　　為了評估肝細(xì)胞的功能，培養(yǎng)基在上一次更

54、換的24小時(shí)后會(huì)被采集。功能性研究從采集的上清液或者整個(gè)類器官中完成，就像擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟中描述的那樣。</p><p><b>　　移植</b></p><p>　　我們用了一個(gè)Guo等人的修改版的實(shí)驗(yàn)報(bào)告(Guo et al.,2002)。簡單來說，我們對缺乏BALB/c的雌性裸鼠注射了兩針70 mg/kg Retrorsine (Sigma)，分別是在移植前30和1

55、4天。移植前一天，老鼠通過IP注射得到了0.5 ml/kg CCl4 還有50 mg/animal anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries)。另外，動(dòng)物還接受7.5 ug/ml FK506在飲用水中，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束肝重生報(bào)告成陽性。(He et al., 2010)移植當(dāng)天，老鼠被麻醉，從4個(gè)獨(dú)立供體（p6-p10）或者新分離的肝細(xì)胞（兩個(gè)供體）得來的1–2 3 106 個(gè)人肝臟類器官

56、細(xì)胞懸液被注射到脾臟內(nèi)。移植的小鼠每周都要注射50 mg/animal anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries)來消耗NK細(xì)胞。為了監(jiān)測移植狀態(tài)，我們規(guī)律的從尾部靜脈抽取血樣并用每個(gè)人特異性的ELISA (Assaypro)分析當(dāng)前人白蛋白和人a1-antitrypsin。</p><p>　　核型分析和遺傳穩(wěn)定性分析</p><p>

57、　　成指數(shù)形式增長的類器官培養(yǎng)物在16小時(shí)內(nèi)都被輔以0.05 ug/ml秋水仙堿(GIBCO)。然后，培養(yǎng)物被TrypLE express (GIBCO)分成單個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的核型分析。</p><p>　　用來進(jìn)行WGS分析的DNA文庫是用標(biāo)準(zhǔn)方法從1ug的遺傳DNA中產(chǎn)生的(Illumina)。作為參考樣本，不同供體的肝活檢被排成統(tǒng)一的深度。序列讀數(shù)、基因拷貝數(shù)變異的調(diào)用還有堿基替換的分析都在擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟

58、中被具體描述。整個(gè)的基因序列的數(shù)據(jù)被存放在EMBL歐洲核苷酸檔案中，編號ERP005929。</p><p>　　免疫組織化學(xué)，免疫熒光和圖像分析</p><p>　　組織和類器官被分別固定在甲醛或者4%的PFA中，并像擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟中描述的那樣染色、成像。</p><p>　　A1AT-D功能實(shí)驗(yàn)</p><p>　　彈性纖維酶抑制法還有磷酸

59、化的elF8α的檢測都如擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟中所寫。</p><p><b>　　微陣列</b></p><p>　　為了分析人肝培養(yǎng)物的表達(dá)，整個(gè)RNA都被從肝臟活檢或者我們規(guī)定的培養(yǎng)基中生長的類器官培養(yǎng)物中分離出來，按廠商說明使用QIAGEN RNA酶試劑盒。500ng的RNA被標(biāo)記出來，只有少部分RNA被輸入線性放大盒(Agilent Technologies)。通用的

60、人rRNA (Agilent)被差異的標(biāo)記，并與組織或者培養(yǎng)樣本雜交。使用4X 44 K Agilent整個(gè)人類基因基因組雙色微陣列(G4122F)。標(biāo)記、雜交和沖洗都是按照Agilent指南操作的。微陣列信號還有背景信息都用Feature Extraction software (V.9.5.3, Agilent Technologies)取得。分層聚群分析在整個(gè)肝組織或者類器官實(shí)驗(yàn)中被使用。在分層聚群分析中還用到了一個(gè)3倍體的切片。

61、</p><p><b>　　數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　所有值都表示為平均的掃描電鏡。我們還使用了人Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)。在所有情況下，使用的數(shù)據(jù)是從至少三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得來的。所有的計(jì)算采用SPSS軟件包進(jìn)行。</p><p><b>　　序列號</b></p><p>　　克隆類

62、器官培養(yǎng)物的全部基因序列數(shù)據(jù)已經(jīng)被儲(chǔ)存到EMBL歐洲核苷酸檔案中，序列號ERP005929。本實(shí)驗(yàn)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)被存到GEO知識庫，序列號GSE63859。</p><p><b>　　補(bǔ)充信息</b></p><p>　　補(bǔ)充信息包括擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟，7個(gè)圖表還有5個(gè)表格。本文獻(xiàn)可以從以下地址找到：http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.201

63、4.11.050</p><p>　　AUTHOR CONTRIBUTIONS（省略）</p><p>　　REFERENCES（省略）</p><p>　　圖表1從導(dǎo)管細(xì)胞得來的生長的肝類器官</p><p>　　3000或10000人初代肝臟細(xì)胞被種到48孔板的每個(gè)孔里，像說明的那樣使用不同的培養(yǎng)條件。</p><p&

64、gt;<b>　　實(shí)驗(yàn)計(jì)劃方案</b></p><p>　　老鼠肝臟培養(yǎng)皿(ERFHNic)或者補(bǔ)充了A8301(A)或者 A8301和Forskolin(FSK)的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)物每隔7-10天分離，在1:4-1:8稀釋。補(bǔ)充A8301和FSK會(huì)顯著增加擴(kuò)增效率。生長大于18代，分裂比是1:4-1:6每7-10天，持續(xù)大于5個(gè)月。實(shí)驗(yàn)三份，每條都表示不同的供體。</p><

65、;p>　　老鼠肝臟培養(yǎng)基中有A8301和有（左）或者沒有（右邊）FSK類器官的DIC圖像，放大率4X</p><p>　　群落形成效率百分比：在有或者沒有A8301和/或FSK。實(shí)驗(yàn)三份，來自五個(gè)供體。結(jié)果被呈現(xiàn)成五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均掃描電鏡。</p><p>　　（E-G）擴(kuò)增率，體外生長曲線，EdU摻入量在EM里培養(yǎng)的在早期和末期的代的細(xì)胞被分析。E和F圖片說明了每代細(xì)胞每個(gè)孔里數(shù)

66、到的細(xì)胞數(shù)：從P1-P4(E),P16-P18(F)。結(jié)果被表示成三個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的平均掃描電鏡。數(shù)目翻倍的時(shí)間被計(jì)算出來，就像擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)步驟描述的那樣。（G）EdU摻入量仍舊在末代中被檢測出來。</p><p>　?。℉）人肝臟細(xì)胞懸液被分開到EpCAM+導(dǎo)管細(xì)胞和更大的EpCAM-肝細(xì)胞中（如需要確切的選擇策略，參見圖表S2C）。群體的鑒定結(jié)果被白蛋白和KRT19染色確認(rèn)。分出來的細(xì)胞培養(yǎng)了14天。類器官是專門從

67、EpCAM+導(dǎo)管細(xì)胞中獲得的。</p><p>　　同樣參見圖表S1，S2。</p><p>　　圖表2人類器官在培養(yǎng)中保持遺傳學(xué)穩(wěn)定性</p><p>　　克隆的培養(yǎng)物是在每個(gè)孔中種一個(gè)分出來的細(xì)胞得到的。DIC圖像放大倍率是：40X (0–10天), 4X (20天之前).</p><p>　　實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。2個(gè)獨(dú)立的供體的肝臟活檢被培

68、養(yǎng)1周。單個(gè)細(xì)胞生長成群。得到了兩個(gè)獨(dú)立的類器官培養(yǎng)物。在長期的擴(kuò)增之后，第二步克隆擴(kuò)增開始實(shí)施。作為結(jié)果的類器官培養(yǎng)物接受了WGS分析。為了獲得所有的體細(xì)胞變異，變異體在原始的活檢中被過濾。為了決定長期培養(yǎng)對遺傳穩(wěn)定性的影響，體細(xì)胞變異被從早期代數(shù)的培養(yǎng)物中過濾出去。</p><p>　　扇形圖說明了每個(gè)供體被調(diào)查的基因的百分比。右邊面板顯示的是觀察到的堿基替換的總數(shù)。說明的是每個(gè)培養(yǎng)物體細(xì)胞堿基替換的總數(shù)，還

69、有被長期誘導(dǎo)培養(yǎng)的數(shù)目。</p><p>　　左面板說明的是體細(xì)胞堿基替換的總數(shù)，右面板說明的是影響蛋白編碼DNA的因素。參見圖表S3。</p><p>　　圖表3人肝臟類器官的結(jié)構(gòu)性變異</p><p>　　代表性的染色體圖像：類器官培養(yǎng)了16天（P1）和90天（P14）。是正常的染色體數(shù)（n=46）。在任何分析的樣本里（n=15）沒有主要染色體的異常。具體的染色

70、體數(shù)目在圖表S4中展示。</p><p>　　從活檢中（上）和從供體2得來的培養(yǎng)物A中（下）不同的染色體中獲得的整個(gè)基因組序列數(shù)據(jù)的讀全分析。</p><p>　　在培養(yǎng)物A中，對于3號染色體一個(gè)區(qū)域的拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)了雜合子增益。</p><p>　　對兩個(gè)供體不同類器官培養(yǎng)物的拷貝數(shù)分析的總結(jié)。從供體2獲得的在培養(yǎng)物A的體細(xì)胞拷貝數(shù)變異被專門觀察到，并且已經(jīng)存在于

71、父代培養(yǎng)物。</p><p><b>　　參見圖表S4。</b></p><p>　　圖表4人肝臟類器官標(biāo)記的表達(dá)</p><p>　　（A和B）用RT-PCR（A）和免疫熒光（B）在EM中生長的人肝臟培養(yǎng)物中分析基因表達(dá)。</p><p>　　基因表達(dá)在早期和晚期被分析。人肝臟培養(yǎng)物表達(dá)出祖細(xì)胞(LGR5, SOX9)

72、，導(dǎo)管細(xì)胞(KRT19, SOX9)和肝臟細(xì)胞(HNF4A)的標(biāo)記，但是沒有白蛋白標(biāo)記（ALB）。結(jié)果指示成2-dCt (2DDCT)。代表從5個(gè)獨(dú)立供體培養(yǎng)物得來的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)平均掃描電鏡的值。2DDCT被計(jì)算出使用持家基因GAPDH作為編碼基因。組織，整個(gè)肝臟溶解產(chǎn)物。</p><p>　　(B-F)共聚焦圖像染色ECAD和肝細(xì)胞標(biāo)志HNF4（B）和導(dǎo)管標(biāo)記（KRT19 [C]，[D]和Sox9 KRT7，[

73、E ]）。原子核Hoechst染色。（F）共聚焦圖像染色EPCAM（藍(lán)色）。干細(xì)胞標(biāo)記Lgr5（綠色）被限制在Wnt靶基因EphB2（紅色）的細(xì)胞染色的一個(gè)子集里?？潭葪l，50 um (B–E 還有 F, 左); 25 um (F, 右)。</p><p><b>　　參見圖表S5。</b></p><p>　　圖表5類器官分化成肝細(xì)胞</p><

74、p>　　人肝臟培養(yǎng)物擴(kuò)增一個(gè)月以上然后被轉(zhuǎn)移到DM里。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)策略</b></p><p>　　（B和C）肝細(xì)胞基因的表達(dá)決定于熒光標(biāo)記（B）或者qPCR (C) 在11天之后。（B）白蛋白的熒光標(biāo)記(ALB,紅色)還有ZO-1(綠色)。刻度條：25um左；30um右。(C)對于白蛋白和細(xì)胞色素p450 3A4的qPCR分析。圖像說明的

75、是三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均電鏡掃描。組織：肝臟的整個(gè)裂解液。**EM與DM p<0.01</p><p>　　EM里生長的或者DM里培養(yǎng)11天的人肝細(xì)胞培養(yǎng)物的整個(gè)基因組的轉(zhuǎn)錄組分析。熱圖顯示基因簇高度表達(dá)在肝組織和分化的類器官里。值得注意的是，這個(gè)基因簇包含了必須的基因，如同說明的那樣，是紅色的。綠色，下調(diào)的；紅色，上調(diào)的。</p><p><b>　　參見圖表S5。<

76、/b></p><p>　　圖表6肝臟培養(yǎng)物在體內(nèi)和體外顯示出肝細(xì)胞功能</p><p>　　在EM或者DM中生長11天的類器官的糖原累積是通過PAS（Periodic-Acid Schiff）染色的。PAS染色（粉色）被專一的觀察到，在分化后（DM），說明累積糖原的能力。放大倍率：10X</p><p>　　LDL占用是用Dil-ac-LDL熒光底物（紅色）

77、分析的，在EM(左)或者DM（右）中培養(yǎng)11天之后。只有DM中保留的培養(yǎng)物結(jié)合了底物（紅色）。細(xì)胞核被DRAQ5復(fù)染。刻度條，25um。</p><p>　　在24小時(shí)里白蛋白產(chǎn)物是在上清液中測量的。結(jié)果用平均掃描電鏡表示。</p><p>　　CYP3A4活性是用DM里培養(yǎng)11天的培養(yǎng)物測量的。結(jié)果表現(xiàn)為RLU/ml/百萬個(gè)細(xì)胞。HEK293T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞被分別用作正向和逆向控制

78、。值得注意的是在DM上的DM類器官顯示CYP3A4的活性，就像新鮮分離出來的肝細(xì)胞。（圖表S2A）每種條件三份實(shí)驗(yàn)都被分析。結(jié)果展示為4個(gè)獨(dú)立供體分離出來的培養(yǎng)物所做的2個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均電鏡掃描。</p><p>　　Midazolam代謝由于功能性CYP3A3/4/5酶被專一性實(shí)現(xiàn)。從兩個(gè)不同的供體得來的三個(gè)不同的類器官培養(yǎng)物和HepG2細(xì)胞都如同描述被培養(yǎng)了11天。Midazolam被加入培養(yǎng)基（5uM），

79、24小時(shí)后確定了1-OH咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖葡糖苷酸的濃度。每個(gè)條件和供體的副本都被分析。結(jié)果表示為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均電鏡掃描。</p><p>　　用兩個(gè)獨(dú)立供體分離出來的培養(yǎng)物做的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的膽汁酸產(chǎn)物用掃描電鏡展示。每個(gè)條件和供體的副本都被分析。</p><p>　　氨消除，用n=3的用兩個(gè)獨(dú)立供體分離出來的培養(yǎng)物做的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的掃描電鏡展示。用nM/h/百萬個(gè)細(xì)胞給出。<

80、;/p><p>　　Retrorsine/CCl4處理的Balbc/裸鼠被一直了1-2X106個(gè)人的肝臟類器官細(xì)胞，在120天后死亡。人Albumin+/ KRT19-的肝細(xì)胞的病灶的存在表明在小鼠肝臟的移植和分化。</p><p>　　移植后人血清白蛋白水平。結(jié)果用兩方面控制的動(dòng)物，兩個(gè)主要肝細(xì)胞移植的老鼠還有六個(gè)人類肝臟類器官移植的動(dòng)物的掃描電鏡展示。</p><p&g

81、t;　　**p < 0.01 *p < 0.05 比較EM與DM時(shí)。參見圖表S5和S6。</p><p>　　圖表7人A1AT缺乏肝臟培養(yǎng)物作為體內(nèi)疾病模型</p><p>　　A1AT缺乏的患者分離的肝臟類器官在第二代和第11代（4X放大）</p><p>　　白蛋白從供體分泌到上清液中，A1AT缺乏患者類器官在EM或者在DM里11天后。結(jié)果被表述為兩

82、個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均電鏡掃描。</p><p>　　A1AT缺乏類器官分化了11天，并且用DiI-Ac-LDL培育。熒光顯微鏡顯示出強(qiáng)大的LDL占用在病人的類器官里?？潭葪l：50um</p><p>　　在供體和A1AT患者類器官分化11天后的白蛋白和CYP3A4 mRNA水平的代中誘導(dǎo)。結(jié)果用平均電鏡掃描表示。</p><p>　?。‥-H）肝組織（E和G）上的、健康

83、供體肝細(xì)胞分離的類器官（F）上的還有典型A1AT缺乏患者的A1AT的免疫組織化學(xué)。</p><p>　?。℉）箭頭指出A1AT蛋白在病人分離的肝組織（G）和類器官（H）處聚集?？潭葪l，20um。</p><p>　　（I）A1AT從分化后11天的供體和病人的類器官分泌到上清液的ELISA測量。結(jié)果被表達(dá)為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均掃描電鏡。</p><p>　　（J）分化的